腦缺血后神經(jīng)可塑性與修復的研究.pdf

1、目的 腦缺血后神經(jīng)可塑性與修復是近年來研究的熱點，選擇怎樣的動物模型及腦保護劑是其研究的基礎。本研究介紹一種標準的小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的制作，并觀察腦梗死體積和腦水腫的變化。研究羅伐他汀(rosuvastatin)、氨甲酰促紅細胞生成素(CEPO)、促紅細胞生成素(EPO)對缺血性腦損傷的保護作用及機制。探討多藥耐藥蛋白(P糖蛋白，P-glycoprotein,P-gp)對FK506通過血腦屏障(BBB)進入腦內(nèi)濃度及其

2、腦保護功能的影響。應用三級康復方案對急性腦卒中患者生理功能、生存質(zhì)量的影響及衛(wèi)生經(jīng)濟學評價，為腦血管病的康復制定最佳策略。 方法 用腔內(nèi)線栓法制作腦缺血/再灌注動物模型(MCAO)；用TTC染色法進行腦大體觀察；用甲酚紫染色法觀察腦切片梗死灶；用腦血流激光多普勒監(jiān)測腦缺血過程中腦血流的變化；用ImageJ軟件計算腦梗死體積和腦水腫；用蛋白免疫印跡法分析腦缺血前后內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和活化型caspase-3(a

3、ctivatedcaspase-3)的變化；用免疫組織化學方法觀察腦缺血再灌注后誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的改變。用免疫組織化學方法和westernblot觀察P-gp的表達；用ELISA法檢測血和腦組織FK506濃度；用TUNEL法觀察凋亡細胞。42例腦卒中偏癱患者被隨機分成康復組和對照組。兩組患者急性期(21天內(nèi))均進行早期康復治療。恢復期康復組于康復機構(gòu)康復治療2個月，再到社區(qū)或家庭康復治療3個月，對照組自行在家練習。分別采用

4、美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)、Fugl-Meyer運動功能評定(Fugl-Meyerassessment，F(xiàn)MA)、改良巴氏指數(shù)(modifiedbarthelindex，MBI)、SF-36量表來評定療效。采用成本—效果分析及增量分析進行衛(wèi)生經(jīng)濟學評價。 結(jié)果 (一)小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的制作及可重復性論證：(1)當線栓封閉大腦中動脈時，腦血流就會急劇下降至最低水平，拔出線栓后腦血流迅速上升至缺血前水平

5、。(2)腦缺血后，腦片上呈現(xiàn)明顯的梗死灶，腦梗死體積和腦水腫的大小較恒定。(3)腦缺血30min再灌注24h組梗死體積、腦水腫體積和腦水腫百分數(shù)分別為81.3±5.6mm3、61.6±3.5mm3、38.5±2.3％，顯著小于腦缺血90min再灌注24h組(分別為105.2±8.9mm3、79.3±6.4mm3、49.6±3.9％)(P＜0.001)。(4)腦缺血30min再灌注24h和72h腦水腫非常明顯，分別為61.6±3.5mm3

6、、72.6±4.3mm3(P＜0.001)，再灌注7天時腦水腫開始減退，僅為50.9±4.1mm3，再灌注30天時腦容積出現(xiàn)萎縮，腦水腫呈負值(-20.1±1.8mm3)。 (二)羅伐他汀對缺血性腦損傷的保護作用及機制：(1)rosuvastatin0.5mg/kg、rosuvastatin5mg/kg組與對照組的梗死體積、腦水腫的差異無顯著性意義，但rosuvastatin20mg/kg可以明顯減少梗死體積，減輕腦水腫。(2)

7、westernblots顯示腦缺血前腦組織eNOS表達為100±43.3％，缺血后明顯升高至1668.9±112.2％(P＜0.001)，rosuvastatin可以使非缺血區(qū)腦組織eNOS表達從100±43.3％上調(diào)至511.4±68.7％(P＜0.001)，但rosuvastatin組缺血區(qū)腦組織eNOS表達為1678.8±121.3％，與對照組缺血區(qū)腦組織eNOS表達(1668.9±112.2％)比較差異無顯著性意義(P＞0.05

8、)。(3)非缺血區(qū)皮層無activatedcaspase-3表達，腦缺血后activatedcaspase-3表達上升至88.3±15.6％，rosuvastatin可使之顯著降至42.1±11.2％(P＜0.01)。(4)免疫組織化學顯示非缺血腦組織無iNOS陽性細胞表達，腦缺血再灌注后iNOS表達增至2.6±1.8cells/sq.，rosuvastatin20mg/kg可明顯減少iNOS的表達(0.6±0.3cells/sq.)(

9、P＜0.05)。 (三)抑制P-糖蛋白可加強FK506對缺血性腦損傷的保護作用：(1)MCAO30min再灌注3小時大腦皮質(zhì)和紋狀體中P-gp的表達即開始顯著升高，持續(xù)至24小時，分別升高55.3％和67.9％(P＜0.05)；但再灌注72小時P-gp表達已不再升高，MCAO90分鐘組P-gp的表達升高幅度較MCAO30分鐘組大。提示腦缺血后P-gp的表達在早期一過性升高。(2)腦缺血前后，P-gp抑制劑tariquidar(T

10、QD)對血中FK506濃度的影響無顯著性差異(P＞0.05)；使用TQD后，非缺血側(cè)大腦半球FK506濃度無顯著性變化，但在缺血側(cè)大腦半球FK506濃度顯著升高，腦與血的濃度比率平均從6.3上升至42.2(P＜0.001)，提示腦缺血后P-gp表達過多，阻止了FK506進入腦組織，當TQD抑制P-gp的活性后，F(xiàn)K506進入腦組織的量迅猛上升。(3)FK506在較低劑量(1mg/kg和3mg/kg)無抗細胞凋亡作用，只有較大劑量(5mg

11、/kg)才有抗細胞凋亡作用，凋亡的細胞數(shù)從對照組的81.2±12.3下降至46.5±9.2(TUNEL(±)細胞數(shù)/square)(P＜0.001)。單獨使用TQD無抗細胞凋亡作用，當TQD與FK506合用時，F(xiàn)K506較低劑量(1mg/kg)即可發(fā)揮抗細胞凋亡作用。(4)單獨使用TQD或FK5063mg/kg無顯著減少腦梗死體積的作用，當FK5063mg/kg與TQD合用時，腦梗死體積從113.5±11.1mm3顯著降低至70.6±1

12、0.2mm3(P＜0.01)，而FK5065mg/kg可使腦梗死體積降低至85.2±10.1mm3(P＜0.01)。提示TQD抑制P-gp活性，使FK506對缺血性腦保護作用的閾值從5mg/kg降低至1mg/kg。 (四)氨甲酰促紅細胞生成素對缺血性腦損傷的保護作用：(1)CEPO50μg/kg與較高劑量EPO(50μg/kg)具有相同的減少神經(jīng)功能缺損評分作用，而低劑量EPO(5μg/kg)時無此作用；(2)NS組、EPO5μ

13、g/kg組、EPO50μg/kg組、CEPO50μg/kg組的腦梗死體積分別為103.2±10.1、98.7±11.2、66.9±8.3、67.1±8.5mm3，腦水腫體積分別為78.9±6.8、76.8±7.3、52.2±5.4、53.1±5.6mm3；(3)EPO50μg/kg使大腦皮層細胞凋亡數(shù)從對照組的94.2±15.2/sq.下降至40.5±9.8/sq.(P＜0.001)，CEPO50μg/kg的抗細胞凋亡作用與EPO50μ

14、g/kg相似；(4)CEPO和EPO腦缺血后大腦皮層eNOS無明顯影響，但CEPO50μg/kg可使activatedcaspase-3表達從95.4±16.7％明顯下降至43.5±13.1％(P＜0.001)，EPO50μg/kg也有類似作用，而EPO5μg/kg無此作用；(5)CEPO50μg/kg使缺血皮層iNOS表達從NS組的3.1±1.9cells/sq.下降至0.7±0.2cells/sq.,(P＜0.05)，EPO50μg

15、/kg組的表達與CEPO50μg/kg組相似，為0.8±0.2/sq.。 (五)急性腦卒中患者應用三級康復程序的效果和衛(wèi)生經(jīng)濟學評價：(1)腦卒中急性期(21天內(nèi))，康復組與對照組患者NIHSS、FMA及MBI的改善程度，差異無顯著性意義(P＞0.05)；而恢復期(21d后～6個月)的各個階段，康復組明顯好于對照組(P＜0.01)。(2)在康復后6個月及2年隨訪時，康復組的生存質(zhì)量各個維度明顯改善，與對照組相比差異有顯著性意義(

16、P＜0.05)；(3)康復組患者神經(jīng)功能缺損積分每減少1分、運動功能及日常生活活動能力每提高1分需分別花費人民幣2412.5元、442元和332.1元，而對照組則分別需花費3285.4元、637.8元和447.5元。 結(jié)論 (1)該小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型具有重復性好、容易操作。(2)rosuvastatin通過增加eNOS的表達、抑制iNOS和activatedcaspase-3的表達而起到神經(jīng)保護作用。(3)TQ

17、D抑制P-gp活性，增加FK506進入腦內(nèi)的濃度，降低FK506腦保護作用的閾值，從而加強FK506的神經(jīng)保護作用。(4)低劑量的EPO(5μg/kg)無腦保護作用。CEPO50μg/kg與較高劑量EPO(50μg/kg)具有相似的減少梗死體積、縮小腦水腫、抗細胞凋亡作用，它們通過減少activatedcaspase-3和iNOS的表達而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。(5)三級康復方案對腦卒中患者功能恢復及生存質(zhì)量具有良好的促進作用，而且更為經(jīng)濟。