Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶在癌細(xì)胞中表達(dá)及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的： 檢測Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP dependent proteinKinase Ⅱ，PKG Ⅱ)在相同組織來源的正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和癌細(xì)胞中的表達(dá)及活性的差異，探討相關(guān)的機(jī)制，以及PKGⅡ在基因調(diào)控中的作用。 研究方法： (1)選擇相同組織來源的正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和癌細(xì)胞株，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測PKGⅡ mRNA表達(dá)水平差異。 (2)選擇相同組織來源的正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和癌細(xì)

2、胞株，通過Western blotting方法檢測PKGⅡ蛋白表達(dá)水平差異。 (3)以8-pCPT-cGMP特異性激活PKGⅡ，通過Westem blotting方法檢測PKGⅡ底物血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulatedphosphoprotein，VASP)的磷酸化以反映PKGⅡ的活性。 (4)用PCR方法擴(kuò)增PKGⅡ啟動子區(qū)的序列，進(jìn)行測序分析，闡明在腫瘤細(xì)胞中PKGⅡ啟動子有無突變。

3、 (5)選擇代表性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染編碼PKGⅡ的質(zhì)粒DNA，以8-pCPT-cGMP特異性激活PKGⅡ，用mRNA差異顯示技術(shù)檢測PKGⅡ在基因調(diào)控中是否存在作用。 研究結(jié)果： (1)在大鼠和人來源的細(xì)胞株中，PKGⅡ在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中基因水平表達(dá)較高，而在癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。 (2)在大鼠和人來源的細(xì)胞株中，PKGⅡ在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中蛋白水平表達(dá)較高，而在癌細(xì)胞中的表達(dá)低。 (3)在大鼠和人來源的細(xì)胞株中，VASP

4、在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中磷酸化水平較高，而在腫瘤細(xì)胞中磷酸化水平較低，推斷出PKGⅡ在癌細(xì)胞的活性明顯低于轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 (4)在人胃癌細(xì)胞SGC-7901中，PKGⅡ啟動子區(qū)域存在著堿基突變。 (5)在代表性細(xì)胞Cos7細(xì)胞中，未見PKGⅡ?qū)蛘{(diào)控有明顯的影響。 研究結(jié)論： 在相同組織來源的情況下，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，PKGⅡ在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和活性較低；在人胃癌細(xì)胞SGC-3901中，PKGⅡ啟動子區(qū)域存在著堿基突變；