細胞周期素依賴性蛋白激酶調控細胞死亡的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：CDK1與細胞凋亡
　　 目的：探討CDK1 在細胞凋亡中的重要作用及其機制研究。
　　 材料和方法：先后構建了表達CDK1的質粒、突變了CDK1 主要磷酸化位點（包括Thr161和Tyr15）的質粒和能有效沉默CDK1表達的RNAi，以肝癌細胞Hela 為研究對象，以紫外打擊為凋亡的主要誘導方式，采用MTT法、流式細胞學分析、流式細胞學分選技術、免疫熒光分析、蛋白質免疫共沉淀

2、技術、Western blot 分析等技術分析細胞在遭受外界打擊的條件下，CDK1 蛋白與凋亡相關蛋白的相互作用關系。
　　 結果：
　　 1）我們成功構建了能夠表達CDK1 蛋白的真核表達質粒，能夠有效沉默CDK1表達的RNAi和突變了Thr161位蛋白和Tyr15位蛋白的表達CDK1 質粒；高表達CDK1的細胞在紫外線打擊下凋亡率顯著增加；沉默CDK1表達的細胞在紫外線打擊下凋亡率顯著下降；進而發(fā)現(xiàn)，當細胞引入突變了

3、Tyr15位蛋白的CDK1 質粒時，紫外誘導的G1 期特異性細胞凋亡是增加的；當細胞引入突變了Thr161位蛋白的CDK1 質粒時，紫外打擊導致的細胞的G1 期凋亡相對有所減少，免疫共沉淀顯示帶有Flag 尾Tyr15突變體其Thr161位點可以被磷酸化。
　　 2）在低血清培養(yǎng)誘導的細胞G1 期阻滯模型中，當紫外打擊后根據(jù)不同的時間點我們對細胞進行了分選，與對照組相比，紫外打擊組細胞內(nèi)Phospho-cdc2 (Tyr15)的

4、表達是逐漸下降，而同時出現(xiàn)了Phospho-cdc2 (Thr161)表達的上升；對照組和紫外打擊組內(nèi)CDK2 處于低水平表達,沒有出現(xiàn)顯著性改變；凋亡相關蛋白檢測發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達上調。
　　 3）對細胞紫外線打擊后分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，結果顯示紫外打擊組胞核中Phospho-cdc2 (Tyr15)表達與對照組無明顯差異，而胞漿中出現(xiàn)了顯著下降。
　　 4）免疫熒光分析顯示，細胞在紫外打擊后少量的Ph

5、ospho-cdc2 (Tyr15)出現(xiàn)了聚集于凋亡小體處的現(xiàn)象，Phospho-cdc2 (Thr161)濃聚在胞漿中。
　　 結論：
　　 1）CDK1表達過多可以促使凋亡的發(fā)生，抑制CDK1的表達可以減少細胞的凋亡。
　　 2）通過向細胞引入外源性表達的CDK1 相關磷酸化位點突變體后其Thr161 蛋白可以被磷酸化，而磷酸化的后果是促發(fā)了凋亡。而引入Thr161突變的CDK1 并沒有顯著抑制凋亡的發(fā)生。<

6、br>　　 3）從時間的觀點看來，CDK1 在G1 期如果出現(xiàn)了異常激活則可能直接導致凋亡的發(fā)生；從空間的角度理解，CDK1 Thr161 磷酸化后若異常停留在胞漿中，和（或）CDK1Tyr15 以磷酸化的方式入核或在胞漿中去磷酸化也是凋亡發(fā)生的必然條件之一。
　　 第二部分：CDK1與細胞自噬
　　 目的：
　　 探討CDK1在細胞自噬中的重要作用。
　　 材料和方法：
　　 先后構建了高表達

7、CDK1的質粒和能有效沉默CDK1表達的RNAi，以肝癌細胞Hela 為研究對象，通過Dhanks 液饑餓為主要誘導方式，采用流式細胞學分析、免疫熒光分析、電鏡和Western blot 分析等技術分析細胞在饑餓所誘導的自噬中，CDK1 蛋白在其中的作用。
　　 結果：
　　 當細胞導入高表達CDK1后，我們可以見到相對于對照組，其自噬相關蛋白表達增加，自噬泡更多且更大；相反，當我們沉默CDK1的表達后，細胞自噬的現(xiàn)象明