壓瘡大鼠骨骼肌組織iNOS的表達(dá)及血清中NO、SOD、MDA變化的觀察.pdf

1、目的：壓瘡(PU)是臨床常見的并發(fā)癥之一，也是治療和護(hù)理的難題，一旦發(fā)生，不僅增加患者的痛苦，加重原發(fā)疾病，延長病程，嚴(yán)重可因繼發(fā)感染而危及生命。本研究采用外加物理壓力作用于大鼠肢體復(fù)制大鼠壓瘡模型，觀察肢體受壓后不同時(shí)間點(diǎn)iNOS在骨骼肌中的表達(dá)情況以及血清中NO、SOD、MDA的含量變化，旨在驗(yàn)證缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)自由基參與骨骼肌損傷的過程，探討自由基參與壓瘡發(fā)生的機(jī)制。 方法：①健康純系Wister大鼠54只，雌雄不限，

2、體重180～220g。隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6只。10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，用一重量為0.56kg的鋼柱垂直施壓于大鼠左后肢，主要受壓的肌肉為股內(nèi)收肌和恥骨肌，鋼柱和肢體的接觸面積為直徑1cm的圓形表面，受壓部位單位面積承受的壓力為70kPa，施壓5h。對(duì)照組動(dòng)物麻醉后仰臥固定于大鼠固定板上5h。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠造模后解除固定，常規(guī)單只分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物根據(jù)肢體受壓

3、5h后放松的時(shí)間不同共分為8組，分別編號(hào)為再灌注組(IR組)：IR0h組、IR4h組、IR12h組、IR24h組、IR3d組、IR1w組、IR2w組、IR4w組。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在施壓5h后，再灌注0h、4h、12h、24h、3天、1周、2周、4周時(shí)，取左后肢施壓部位的股內(nèi)收肌置于4％多聚甲醛中固定后轉(zhuǎn)入30％蔗糖溶液中脫水，OCT常規(guī)包埋，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片；另一部分新鮮受壓部位骨骼肌，液氮速凍后于—70℃保存，備用做Western—b

4、lot檢驗(yàn)骨骼肌中iNOS的表達(dá)。各組大鼠取腹主動(dòng)脈血液，離心后取血漿，—70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?21型分光光度計(jì)，根據(jù)試劑盒操作規(guī)程檢測血清中SOD、NO、MDA的水平。對(duì)照組大鼠同法取材處理。②對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌進(jìn)行HE染色，以觀察肢體受壓后不同時(shí)間點(diǎn)骨骼肌的結(jié)構(gòu)改變。③提取各組大鼠血清，采用硝酸還原酶法測定NO含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力、硫代巴比妥法測定MDA含量。④應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法觀察肢體受壓后不同時(shí)間點(diǎn)iNOS

5、在大鼠骨骼肌中的分布和表達(dá)。⑤蛋白質(zhì)免疫印跡(Western—blot)方法檢測大鼠骨骼肌中iNOS的表達(dá)情況。 結(jié)果：⑴對(duì)照組骨骼肌纖維形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌的發(fā)生進(jìn)行性損傷：出現(xiàn)肌纖維水腫、橫紋消失、空泡變、溶解、斷裂等變化。以缺血再灌注24小時(shí)最重，表現(xiàn)為肌纖維高度水腫，大量骨骼肌纖維空泡變、溶解、斷裂；在IR1周、IR2周組可見骨骼肌水腫逐漸減輕，至缺血再灌注4周，組織損傷仍未完全修復(fù)，仍可見大量溶解、斷裂

6、的骨骼肌，大部分骨骼肌橫紋消失。⑵隨著再灌注時(shí)間的延長，血清中SOD活力呈現(xiàn)先降低后升高的變化：從解除壓力后4h逐漸降低，至第3天降至最低，然后逐漸升高，至2周時(shí)，仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，IR4w組SOD活力恢復(fù)正常；血清MDA的含量表現(xiàn)為先升高后降低：從解除壓力后0h即顯著升高，IR3天組MDA的含量最高，然后逐漸下降，至解除壓力后4周大鼠的血清中MDA含量和對(duì)照組相比仍然具有顯著差異(P<0.05)；血清NO的含量表現(xiàn)為先

7、升高后降低：從0h開始升高，其中IR12h組中NO的含量最高，然后逐漸降低，至2周時(shí)，仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，IR4周組NO含量恢復(fù)正常。⑶iNOS免疫組化切片顯示，在IR4h組、IR12h組、IR24h組、IR3天組有大量iNOS陽性表達(dá)的骨骼肌纖維，iNOS的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。⑷Western—blot方法檢測出，IR4h組、IR12h組、IR24h組、IR3天組中iNOS的表達(dá)水平明顯增加(P<0.

8、05)；組間比較發(fā)現(xiàn)：IR12h組和IR0h組、IR4h組、IR1周組、IR2周組相比iNOS的表達(dá)水平高，差異具有顯著性(P<0.05)；IR24h組和IR0h組、IR4h組、IR3天組、IR1周組、IR2周組相比iNOS的表達(dá)水平高，差異具有顯著性(P<0.05)；IR4周組和IR3天組、IR4h組、IR12h組、IR24h組相比iNOS的表達(dá)水平低，差異具有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論：①缺血再灌注損傷參與壓瘡的形成，血