蛇床子總香豆素主要有效組份在大鼠和人肝微粒體中的代謝研究.pdf

1、背景：
　　 蛇床子的有效成分為香豆素類化合物，其中含量最高的兩種香豆素類化合物為蛇床子素(Osthole，Ost)、歐前胡素(Imperatorin，Imp)。但目前大多數(shù)對蛇床子以及Ost、Imp兩種香豆素單體的研究報道集中在它們的藥效方面，對其藥代動力學(xué)及代謝途徑的研究就比較局限。本課題預(yù)期通過對Ost及Imp體外代謝情況的研究，豐富對蛇床子總香豆素主要有效組份的認(rèn)識，闡明參與藥物代謝的酶，評價藥物與代謝酶間的相互作用，為

2、理解藥物代謝的機(jī)制、預(yù)測藥物相互作用和藥物代謝多態(tài)性以及指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 通過肝微粒體體外代謝研究法研究中藥蛇床子中的有效單體蛇床子素(Ost)、歐前胡素(Imp)在大鼠和人肝微粒體中的代謝途徑和機(jī)制，探明Ost，Imp在大鼠和人肝微粒體中的酶促動力學(xué)特征，以及CYP450酶抑制劑對Ost，Imp代謝的影響，明確參與Ost和Imp在大鼠和人肝微粒體中代謝的相關(guān)CYP450酶。豐富對蛇床子

3、總香豆素主要有效組份的認(rèn)識，為更深入地研究其藥代動力學(xué)及臨床上合理用藥提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、建立Imp，Ost的HPLC-UV檢測方法。
　　 2、通過溫孵時間、肝微粒體濃度、底物濃度三個方面來考察Imp在大鼠和人肝微粒體中的酶促動力學(xué)特征。
　　 3、研究CYP3A4抑制劑酮康唑、CYP2D6抑制劑奎尼丁、CYP2C9抑制劑磺胺苯吡唑、CYP2C8抑制劑甲氧芐氨嘧啶、CYPIA2

4、抑制劑α-萘黃酮對Imp在大鼠和人肝微粒體中代謝的影響。
　　 4、通過溫孵時間、肝微粒體濃度、底物濃度三個方面來考察Ost在大鼠和人肝微粒體中的酶促動力學(xué)特征。
　　 5、研究CYP3A4抑制劑酮康唑、CYP2D6抑制劑奎尼丁、CYP2C9抑制劑磺胺苯吡唑、CYP2C8抑制劑甲氧芐氨嘧啶、CYP1A2抑制劑α-萘黃酮對Ost在大鼠和人肝微粒體中代謝的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、建立了檢測肝微粒體中歐

5、前胡素(Imp)和蛇床子素(Ost)的高效靈敏HPLC方法。
　　 2、Imp在大鼠和人肝微粒體中37℃，120rpm的情況下進(jìn)行孵育，在5-30min均呈線性消除，故選擇的孵育時間為30min；在0.05-0.20 mg/ml范圍內(nèi)，Imp的消除隨肝微粒體蛋白濃度增加而加快，故確定肝微粒體濃度均為0.2mg/ml。在0.8-12.8μM濃度范圍內(nèi)，Imp的代謝消除量隨底物濃度的增加呈近似線性的增加，當(dāng)Imp濃度達(dá)到25.6μM

6、時，它的代謝均呈飽和狀態(tài)，這些均表示Imp在大鼠和人肝微粒體的代謝符合典型的酶促動力學(xué)特征。根據(jù)Eadie-Hofstee方程計算Imp在大鼠和人肝微粒體中的酶促動力學(xué)參數(shù)。在大鼠肝微粒體中：Vmax=31.50±1.32nmol/min/pmol，Km18.34±1.07μM，Clint=1.72±0.11mL/min/pmol；在人肝微粒體中：Vmax=41.37±5.12nmol/min/pmol，Km=14.64±1.91μM，

7、Clint=2.83±0.36mL/min/pmol。
　　 3、甲氧芐氨嘧啶、α-萘黃酮明顯抑制了低中高三個濃度的Imp在大鼠肝微粒體中的代謝。進(jìn)一步在人肝微粒體考察表明α-萘黃酮也能明顯抑制了低中高三個濃度的Imp的代謝，同時奎尼丁對低濃度Imp的代謝以及甲氧芐氨嘧啶對高濃度Imp的代謝也有抑制作用。
　　 4、Ost在大鼠和人肝微粒體于37℃，120rpm/min的情況下進(jìn)行孵育，在5-20min均呈線性消除，故選

8、擇的孵育時間為20min；在0.05-0.20 mg/ml范圍內(nèi)，Ost的消除隨肝微粒體蛋白濃度增加而加快，故確定肝微粒體濃度為0.2mg/ml。在1.6-19.2gM濃度范圍內(nèi)，Ost的代謝消除量隨底物濃度的增加呈近似線性的增加，當(dāng)Ost濃度達(dá)到38.4μM時，它的代謝呈飽和狀態(tài)，這些均表示Ost在大鼠和人肝微粒體的代謝符合典型的酶促動力學(xué)特征。根據(jù)Eadie-Hofstee方程計算Ost在大鼠和人肝微粒體中的酶促動力學(xué)參數(shù)。在大鼠肝

9、微粒體中：Vmax=6.58±0.76nmol/min/pmol，Km=51.17±6.32μM，Clint=7.76±1.01mL/min/pmol；在人肝微粒體中：Vmax=4.36±0.37nmol/min/pmol，Km=36.49±4.21μM，Clint=8.35±1.21mL/min/pmol。
　　 5、酮康唑?qū)Φ椭懈呷齻€濃度的Ost在大鼠肝微粒體中的代謝均有抑制作用；進(jìn)一步在人肝微粒體中考察，結(jié)果表明酮康唑?qū)Φ?/p>

10、中高三個濃度的Ost有抑制作用，同時奎尼丁和磺胺苯吡唑也能抑制高濃度的Ost在人肝微粒體中的代謝。
　　 結(jié)論：
　　 1、建立了靈敏可靠的檢測肝微粒體中蛇床子素(Ost)和歐前胡素(Imp)的HPLC法。
　　 2、Ost和Imp在大鼠和人肝微粒體中的代謝均符合典型的酶促動力學(xué)特征。
　　 3、CYPlA，CYP2C介導(dǎo)了低中高三個濃度Imp在大鼠肝微粒體中的代謝；同時CYP1A2也參與了低中高三個濃度