心理應(yīng)激對大鼠小腸鐵吸收的影響及機制研究.pdf

1、背景： 鐵是幾乎所有活體中的一種必需元素。在細(xì)胞呼吸鏈電子傳遞、能量代謝、血紅素代謝、氧的運輸、細(xì)胞信息傳遞、DNA合成、免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。大量研究表明,鐵缺乏或鐵過量都會對機體產(chǎn)生不利影響,因此維持機體鐵穩(wěn)態(tài)尤為重要,機體缺乏有效的鐵“排泄機制”,機體鐵穩(wěn)態(tài)的維持主要通過腸道鐵吸收的精細(xì)調(diào)控實現(xiàn)。目前對鐵吸收的研究機制發(fā)現(xiàn),小腸中有兩種主要鐵轉(zhuǎn)運體即二價金屬離子轉(zhuǎn)運體DMT1和ferroportin1(FPN1)在鐵

2、吸收調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。DMT1是一種跨膜蛋白,轉(zhuǎn)運二價鐵離子跨越小腸上皮細(xì)胞的頂端進入腸細(xì)胞,FPN1是位于基底膜上的鐵轉(zhuǎn)出蛋白,將鐵離子轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán)。為保證機體的鐵平衡,機體需要在鐵吸收、利用和儲存之間進行協(xié)調(diào),在最近幾年的研究中發(fā)現(xiàn),Hepcidin(由HAMP基因編碼)是鐵穩(wěn)態(tài)的一個主要調(diào)節(jié)因子。Hepcidin是肝細(xì)胞分泌的一種循環(huán)肽,并通過結(jié)合細(xì)胞表面的ferroportin而導(dǎo)致ferroportin的內(nèi)化和降解從而

3、導(dǎo)致鐵釋放減少。 心理應(yīng)激(psychological stress)是機體通過認(rèn)識、評價而察覺到應(yīng)激源的威脅時引起的心理、生理技能改變的過程,是個體對面臨的威脅或挑戰(zhàn)作出適應(yīng)和應(yīng)付的過程。隨著社會的發(fā)展及各方面競爭壓力的增加,來源于社會的精神心理因素的應(yīng)激對人類健康的影響越來越強烈,并成為重要的應(yīng)激源。許多研究證實,在心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、神經(jīng)精神疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生中心理應(yīng)激起了重要作用。軍人作為一個特殊群體,經(jīng)常要

4、面對突發(fā)性事件,如戰(zhàn)爭爆發(fā),反恐怖襲擊執(zhí)行特種任務(wù)等等,這些特殊情況和特種作業(yè)條件都容易誘發(fā)軍人心理應(yīng)激反應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn),心理應(yīng)激可引起機體鐵代謝紊亂,造成血清鐵明顯下降、肝細(xì)胞鐵明顯增加。一方面,鐵缺乏而引起的最大氧攝入和肌細(xì)胞的氧化代謝能力降低,而另一方面,鐵過量又會導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生,故心理應(yīng)激引起機體鐵穩(wěn)態(tài)破壞可影響指戰(zhàn)員的健康,進而影響部隊作戰(zhàn)能力。因此,闡明心理應(yīng)激血清鐵下降和肝臟鐵蓄積的發(fā)生機制,以及預(yù)防和治療措施,無

5、疑將對防治軍人應(yīng)激損傷產(chǎn)生有積極的意義。因此,我們進行了如下研究： 目的： 了解心理應(yīng)激對小腸鐵吸收的影響及其機制探討,為闡明心理應(yīng)激與血清鐵下降的關(guān)系以及深入探討軍事應(yīng)激對機體因鐵穩(wěn)態(tài)改變而引起的作戰(zhàn)能力的下降提供實驗基礎(chǔ),并為防治心理應(yīng)激導(dǎo)致的低鐵血癥提供新思路。 方法： 一、心理應(yīng)激模型的制作。 采用Communication Box System制作大鼠心理應(yīng)激模型。Communicati

6、on Box System由透明丙烯酸板組成,一半小室(A室)底部鋪板絕緣,另一半小室(B室)通電。在B室的實驗大鼠接受30min/d,足底電擊(電壓90V,電流0.80mA);電擊組大鼠跳躍,尖叫,在A室的實驗大鼠通過視覺聽覺產(chǎn)生恐懼的心理反應(yīng),即為心理應(yīng)激大鼠模型。 ELISA法測定血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)含量,放免試劑盒測定下丘腦內(nèi)去甲腎上腺素(NE)含量。 二、心理應(yīng)激對大鼠鐵吸收的影

7、響。 (一)實驗動物分組雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨機分為空白對照組(CG)、心理應(yīng)激7天組(PSG)和足底電擊組(FSG),每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50％～60％；使用不銹鋼代謝籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食及去離子水,飼料配方為AIN-93G,鐵含量為35mg/kg飼料。自然晝夜節(jié)律變化光照。 (二)大鼠心理應(yīng)激模型的制作方法同前。心理應(yīng)激組連續(xù)心理應(yīng)

8、激7天。 (三)大鼠鼠糧攝入量測定每天更換大鼠鼠糧,使用電子天平精確稱量大鼠鼠糧日攝入量。 (四)大鼠糞便收集為使糞便收集齊全,在大鼠從代謝籠中移至心理應(yīng)激模型中,大鼠單個塑料籠轉(zhuǎn)運。為使糞便收集精確,通過卡紅標(biāo)記糞便(收集兩次紅色之間的糞便,不包括第二次紅色糞便)。 (四)大鼠鐵表觀吸收率的計算大鼠鐵表觀吸收率通過經(jīng)典的代謝平衡法計算,即計算一定時間內(nèi)的鐵攝入量及排泄物鐵含量而得,由于尿中鐵含量甚微,可忽略不計

9、。因此鐵表觀吸收率=(攝入鐵含量-糞便鐵含量)×100％/攝入鐵含量。 (五)大鼠小腸Perl's鐵染色各時間段心理應(yīng)激完成后腹腔注射2％戊巴比妥進行麻醉,暴露胸腔,剪開右心耳,然后迅速經(jīng)心臟冷PBS沖洗,取小腸組織4％多聚甲醛固定后石蠟切片制成5μm切片用于Perl's鐵染色。 三、心理應(yīng)激對大鼠小腸鐵吸收機制的影響。 (一)實驗動物分組雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司),體重(120±10)g。按體重隨

10、機分為空白對照組(CG,n=30)、心理應(yīng)激1天組(PSG1,n=10)、心理應(yīng)激3天組(PSG3,n=10)、心理應(yīng)激7天組(PSG7,n=10)和足底電擊組(FSG,n=10)。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃,濕度50％～60％；使用不銹鋼代謝籠具單籠飼養(yǎng),自由飲食及去離子水,飼料配方為AIN-93G,鐵含量為35mg/kg飼料。自然晝夜節(jié)律變化光照。 (二)心理應(yīng)激模型制作方法同前。心理應(yīng)激1天組：心理應(yīng)激1天；心理應(yīng)

11、激3天組：連續(xù)心理應(yīng)激3天；心理應(yīng)激7天組：連續(xù)心理應(yīng)激7天。 (三)心理應(yīng)激對肝臟IL-6含量的影響EUSA法檢測心理應(yīng)激1天組,3天組,7天組及對應(yīng)的空白對照組肝臟IL-6含量。 (四)心理應(yīng)激對小腸Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝臟Hepcidin的影響Wlestern Blot檢測各實驗組及空白對照組小腸粘膜鐵蛋白,二價金屬離子轉(zhuǎn)運體含鐵反應(yīng)原件和非鐵反應(yīng)原件,膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白及肝臟He

12、pcidin蛋白表達(dá)情況。 四、心理應(yīng)激IL-6干預(yù)后對小腸鐵吸收機制影響的研究。 (一)實驗動物分組于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心購得SD雄性大鼠40只,分為正常對照組(CG,n=10)、心理應(yīng)激組(PG,n=10)和心理應(yīng)激干預(yù)組(A-PG,n=10)及軀體電擊組(n=10)。心理應(yīng)激干預(yù)組于應(yīng)激前腹腔注射100μl的PBS(含2μg的IL-6 Antibody)/只大鼠,心理應(yīng)激組于應(yīng)激前注射PBS 100μl/只大鼠

13、。 (二)心理應(yīng)激模型制作方法同前。 (三)心理應(yīng)激IL-6干預(yù)后大鼠十二指腸Perl's染色方法同前。 (四)心理應(yīng)激對大鼠小腸Ferritin,DMT1(+IRE/-IRE),FPN1及肝臟Hepcidin的影響Western Blot檢測各實驗組及空白對照組小腸粘膜鐵蛋白,二價金屬離子轉(zhuǎn)運體含鐵反應(yīng)原件和非鐵反應(yīng)原件,膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白及肝臟Hepcidin蛋白表達(dá)情況五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.

14、0統(tǒng)計軟件包采用兩樣本t檢驗及單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X-±S)表示,顯著性水平為P<0.05,非常顯著性水平為P<0.01。 結(jié)論： 本研究通過Communication Box成功制造了心理應(yīng)激模型,觀察了心理應(yīng)激情況下的鐵吸收變化及通過Western Blotting觀察了心理應(yīng)激對與鐵吸收密切相關(guān)的主要因子的表達(dá)變化。主要結(jié)論如下： 1、隨著心理應(yīng)激的時間延長,大鼠對鐵的吸收

15、減少,同時小腸粘膜鐵染色發(fā)現(xiàn)小腸粘膜細(xì)胞有鐵潴留。 2、隨著心理應(yīng)激時間的延長,肝臟IL-6含量明顯增多,且肝臟Hepcidin表達(dá)增加。進而小腸FP1表達(dá)逐漸減少,提示心理應(yīng)激可能是通過IL-6的升高誘導(dǎo)肝臟Hepcidin的表達(dá)增加,最終影響小腸運出蛋白FP1的表達(dá)減少來抑制小腸鐵吸收。 3、發(fā)現(xiàn)小腸DMT1(+IRE)的表達(dá)變化落后于小腸FP1的變化,提示可能是小腸運出蛋白FP1表達(dá)減少后,促使腸細(xì)胞合成鐵蛋白增加