心理應激致肝鐵蓄積的機制探討.pdf

1、鐵是人體必需微量元素中含量最多的一種，參與機體許多重要的生理功能，鐵過多或過少對機體都會造成損害。鐵缺乏對人體影響被了解的同時，鐵過負荷對人體的危害也越來越受到重視。有資料顯示，肝鐵過負荷可導致肝纖維化、肝硬化；遲發(fā)性皮膚卟啉癥和肝細胞癌等疾病。
　　 肝臟是機體鐵貯存的主要部位，在鐵代謝中發(fā)揮著中心和樞紐的作用。為了維持鐵平衡，肝細胞存在精細的鐵調(diào)控機制，可以維持正常生命活動所需的鐵量，同時又會避免鐵過多蓄積而產(chǎn)生的毒性作用。

2、然而課題組研究發(fā)現(xiàn)心理應激可以引起肝鐵蓄積，肝細胞氧化應激損傷，但機制尚不明確。
　　 眾所周知，應激情況下糖皮質(zhì)激素大量分泌，文獻報道，糖皮質(zhì)激素能夠調(diào)控大鼠腸道內(nèi)鐵蛋白輕鏈重鏈的表達，增加垂體切除鼠體內(nèi)的轉鐵蛋白受體1的含量，有意義的是，課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)應激情況下，糖皮質(zhì)激素受體和STAT5與鐵調(diào)節(jié)蛋白1基因啟動子位點上的相應DNA序列結合活性增強，綜合國內(nèi)外相關研究，提示心理應激情況下的肝鐵蓄積可能與糖皮質(zhì)激素的大量

3、分泌導致鐵調(diào)控蛋白的表達改變有關。應激在現(xiàn)代社會無處不在，闡明應激肝鐵紊亂的機制對防治應激損傷具有積極的意義。
　　 目的:了解心理應激糖皮質(zhì)激素大量分泌與肝鐵蓄積的關系，及心理應激導致肝鐵蓄積的機制，為闡明心理應激情況下肝鐵代謝紊亂、肝鐵蓄積的機制提供實驗基礎，并為防治與肝鐵蓄積相關的疾病提供線索。
　　 方法:
　　 1.心理應激對大鼠肝鐵濃度及鐵調(diào)控蛋白的影響
　　 1.1實驗動物分組
　　

4、 雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司)，體重(120±10)g。按體重隨機分為空白對照組、心理應激組和足底電擊組，每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃，濕度50％～60％；使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然晝夜節(jié)律變化光照。
　　 1.2大鼠心理應激模型的制作
　　 采用Communication Box System制作大鼠心理應激模型。CommunicationBox System由透明丙烯酸板組成

5、，一半小室(A室)底部鋪板絕緣，另一半小室(B室)通電。在B室的實驗大鼠接受30min/d，足底電擊(電壓90V，電流0.80mA)：電擊組大鼠跳躍，尖叫，在A室的實驗大鼠通過視覺聽覺產(chǎn)生恐懼的心理反應，即為心理應激大鼠模型。
　　 1.3大鼠肝組織鐵含量的測定
　　 采用原子吸收分光光度計(日本日立公司Z-2000型)火焰法測定。100μg/ml鐵標準貯備液(GBW08616)由國家標準物質(zhì)中心提供。
　　 1

6、.4大鼠肝臟Fn，TfR1，IRP1，IRP2 mRNA表達量的測定
　　 采用實時定量熒光PCR法測定心理應激組和對照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白，轉鐵蛋白受體1，鐵調(diào)節(jié)蛋白1及鐵調(diào)節(jié)蛋白2 mRNA的表達水平。
　　 1.5大鼠肝臟Fn，TfR1，IRP1蛋白含量的測定
　　 Western blot測定實驗組和對照組大鼠肝臟內(nèi)鐵蛋白，轉鐵蛋白受體1以及鐵調(diào)節(jié)蛋白1的蛋白含量。
　　 2.注射糖皮質(zhì)激素對肝鐵濃

7、度及鐵調(diào)控蛋白的影響
　　 2.1實驗動物分組
　　 雄性SD大鼠(購自上海西普爾-必凱公司)，體重(200±10)g。按體重隨機分為0.9％生理鹽水組，10-9 mol/L皮質(zhì)酮組，10-6 mol/L皮質(zhì)酮組和RU486組，每組10只。動物飼養(yǎng)實驗室環(huán)境溫度24℃±1℃，濕度50％～60％；使用不銹鋼籠具單籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然晝夜節(jié)律變化光照。
　　 2.2實驗動物模型制作
　　 大鼠尾靜脈注射0.

8、9％生理鹽水，10-7mol/L皮質(zhì)酮，10-4 mol/L皮質(zhì)酮或10-2mol/L RU486(1h后再注射10-4mol/L皮質(zhì)酮)，按照0.1ml/100g bw注射試劑，連續(xù)7天注射后腹腔注射10％水合氯醛進行麻醉，暴露胸腔，剪開右心耳，然后迅速經(jīng)心臟冷PBS沖洗，取出大鼠肝臟存-80℃冰箱備用。
　　 2.3大鼠肝組織鐵含量的測定：同前。
　　 2.4大鼠肝臟Fn，TfR1，IRPlmRNA和蛋白含量的測定：

9、同前。
　　 3.糖皮質(zhì)激素調(diào)控肝細胞鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達的分子機制研究
　　 3.1細胞培養(yǎng)
　　 選用人正常肝細胞HL7702，RPMI1640培養(yǎng)液中加入10％胎牛血清、雙抗，培養(yǎng)箱中生長。
　　 3.2氫化可的松干預細胞
　　 用精密電子天平稱取3.6247mg的氫化可的松，用無水乙醇稀釋溶解至1ml，配成10-2mol/L，用1640培養(yǎng)液稀釋成10-5，10-6，10-7，10-8，10-

10、9mol/L后加入HL7702細胞。
　　 3.3 CCK-8法測定肝細胞活性
　　 棄去培養(yǎng)HL7702細胞96孔板中的上清，PBS漂洗3次加入CCK-8反應液，于37℃孵育2h，使用酶標儀450 nn波長處測定吸光度(A)值。以實驗組吸光度值與對照組的吸光度值之百分比作為細胞相對活性。
　　 3.4阻斷HL7702細胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體或STAT5
　　 用精密電子天平稱取4.2959mg的RU486，

11、用無水乙醇稀釋溶解至1ml，配成10-2mol/L的RU486，用1640培養(yǎng)液稀釋為10-5mol/L后加入HL7702細胞，半小時后再加入10-6mol/L氫化可的松。
　　 用精密電子天平稱取適量STAT5抑制劑溶于DMSO，使終濃度達到10mg/ml。
　　 3.5肝細胞IRP1和STAT5 mRNA及蛋白含量的測定
　　 實時定量熒光PCR法測定mRNA的表達水平，Western blot測定蛋白含量的

12、變化。
　　 4.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理
　　 采用quantity one圖像分析系統(tǒng)對Western條帶進行灰度分析，實驗數(shù)據(jù)用((-X)±S)表示。應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，兩組間差異采用成組設計資料的t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析。各組方差齊時，對照組與各實驗組間比較采用Dunnett法，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗；方差不齊時采用Dunnett's C檢驗，P＜0.05為

13、顯著性水平，P＜0.01為非常顯著性水平。
　　 結論:
　　 1.連續(xù)7天心理應激可以引起大鼠肝臟鐵蛋白表達減少，而轉鐵蛋白受體1表達增加，肝細胞攝入鐵增加引起肝鐵蓄積；肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1含量隨著應激天數(shù)增加而增加，通過與IRE結合轉錄后調(diào)控鐵蛋白，轉鐵蛋白受體1的表達可能是心理應激情況下肝鐵蓄積的原因。
　　 2.連續(xù)7天每天注射10-6mol/L的皮質(zhì)酮可以引起大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達上調(diào)、轉鐵蛋白受體1含量

14、增加、鐵蛋白減少、肝臟鐵含量增加，與7天心理應激后大鼠肝臟鐵代謝變化一致，結合以往研究結果提示心理應激時糖皮質(zhì)激素的大量分泌可能是導致大鼠肝臟鐵調(diào)節(jié)蛋白1表達增加的重要原因。
　　 3.通過整體動物和細胞實驗發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可以上調(diào)鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達。分別采用特異性糖皮質(zhì)激素受體抑制劑RU486或STAT5抑制劑后，鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達有不同程度的降低，而在培養(yǎng)基中同時添加上述兩種抑制劑幾乎可完全抑制鐵調(diào)節(jié)蛋白1的表達，表明糖皮質(zhì)