順鉑致卵巢功能早衰發(fā)病機(jī)制與金雀異黃素調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、卵巢功能早衰(premature ovarian failure POF)以40歲前過早絕經(jīng)、低雌激素血癥和高促性腺激素血癥為臨床特征，是一種較為嚴(yán)重的威脅生殖健康的疾病。特別是近年來，隨著腫瘤和免疫性疾病發(fā)病率增加，化療損傷成為近年來POF發(fā)病的一個重要病因。近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈持續(xù)升高，因化療而導(dǎo)致卵巢功能低下和不孕的患者日漸增多，成為POF發(fā)病的一個重要原因?；熤委熡盟幰滓l(fā)生肝、腎毒性，形成肝腎陰虛證，虛火內(nèi)擾，沖任失

2、充，氣血化源不足，性腺失養(yǎng)而功能低下，甚至造成閉經(jīng)和不孕。本病確切病因尚不清楚，在臨床防治中多采用激素替代治療(hormonereplacement therapy，HRT)方法。但大量報道表明，目前的HRT可增加了雌激素依賴性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險。尋找安全、高效物植物藥物是目前POF防治研究中的難點之一。 研究目的： 以建立穩(wěn)定的化療損傷性POF動物模型為平臺，探討GEN對化療損傷性POF的治療作用及機(jī)制，揭示中藥單體的分子

3、藥理作用靶標(biāo)，挖掘POF發(fā)病及GEN治療作用的基因表達(dá)特征，繪制其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的生物信息學(xué)圖譜，從而完善中藥雌激素受體調(diào)節(jié)劑HRT治療作用學(xué)說。 研究方法： 應(yīng)用順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)注射ICR小鼠腹腔給藥方法，構(gòu)建化療損傷性POF動物模型，為系統(tǒng)化研究POF搭建動物實驗平臺；采集大鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，為深入研究POF建立起細(xì)胞研究平臺；運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、電

4、子顯微鏡技術(shù)、蛋白免疫印跡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、流式細(xì)胞分析技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)、基因芯片技術(shù)和生物信息分析技術(shù)等方法，系統(tǒng)研究POF的病理機(jī)制及GEN的影響作用途徑與作用靶點。 研究結(jié)果： 1．化療損傷性POF動物模型建立與評價 應(yīng)用3.0mg/kg劑量的CDDP，對ICR小鼠連續(xù)腹腔注射給藥7d，即可較好地模擬出化療損傷性卵巢功能早衰的發(fā)病過程：其生物學(xué)行為性狀改變符合POF的臨床表現(xiàn)，證屬肝腎陰虛；血清卵巢激

5、素水平下降，促性腺素水平升高；卵巢組織學(xué)出現(xiàn)生長卵泡發(fā)育阻滯，卵泡閉鎖增加，間質(zhì)部分增生、纖維化樣改變。通過病理機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)CDDP是通過兩條途徑影響卵巢功能： ①對DNA直接損傷； ②氧化損傷作用。此模型成功率高，成模時間短，動物模型評價效果好。 2．GEN對化療損傷性POF的治療作用及機(jī)制 GEN可明顯改善模型動物生物學(xué)狀態(tài)，體重增加，周期排卵和動情周期恢復(fù)近正常；血清雌二醇和孕酮水平恢復(fù)近正常，且

6、隨GEN劑量增加，而孕酮表現(xiàn)更為明顯；雌、孕激素受體免疫組化結(jié)果表明，GEN可明顯上調(diào)節(jié)ER和PR表達(dá)，以PR增強(qiáng)為著；GEN可降低卵巢組織中丙二醛(MDA)含量，提高其總抗氧化能力(T-AOC)；GEN可相對降低MMP-2、MMP-9、TGF<,β>和LN的表達(dá)，從而有利于卵巢組織結(jié)構(gòu)的重建，促進(jìn)卵泡成熟與排出；GEN用藥后卵巢顆粒細(xì)胞器豐富，高爾基復(fù)合體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞(間質(zhì)腺細(xì)胞)高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體較

7、多，核糖體豐富。 GEN 可能主要是通過三條作用途徑發(fā)揮其改善卵巢功能的作用： ①較強(qiáng)的抗氧化損傷作用，修復(fù)損傷的DNA，從而激活卵巢顆粒內(nèi)源性蛋白激酶活性，重新構(gòu)建起激素合成與分泌的分子基礎(chǔ)； ②增加卵巢細(xì)胞ER和PR的表達(dá)，提高受體敏感性，并以PR表達(dá)增加為主要，從而對卵巢功能起到自我校正作用； ③調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的形成與降解的平衡，從而改善卵泡和顆粒細(xì)胞功能狀態(tài)，促進(jìn)其分化與成熟。 3．GEN

8、對CDDP作用后卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)節(jié)機(jī)制 CDDP可明顯抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖，其對細(xì)胞周期較為明顯的作用位點是S期，并可使細(xì)胞周期阻滯于G<,1>-M期，凋亡細(xì)胞明顯增加。GEN可對抗CDDP的損傷效應(yīng)，提高細(xì)胞的分化與增殖能力，明顯消除細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，其最佳作用時間點為24h，此作用與GEN呈劑量關(guān)系；GEN可提高卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度，抑制CDDP造成的凋亡作用。 4．POF發(fā)病及GEN影響的差異基因表達(dá)

9、譜 基因芯片信息分析表明，CDDP可上調(diào)137條基因表達(dá)，下調(diào)110條基因表達(dá)，對卵巢細(xì)胞功能表達(dá)起到明顯的抑制作用，這些基因主要作用于DNA合成、跨膜能量代謝和細(xì)胞核因子激活等方面，從而造成部分基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡而致??；GEN可上調(diào)22條基因表達(dá)，下調(diào)38條基因表達(dá)，這些基因主要與激素合成、DNA損傷修復(fù)和能量代謝密切相關(guān)，對于部分細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵通路的建立與網(wǎng)絡(luò)化調(diào)控起到了重要作用。 研究結(jié)論： 通過綜合運(yùn)用