金雀異黃素的抗腫瘤及與輻照聯(lián)合效應(yīng)作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：大豆異黃酮是富含于大豆中的植物雌激素,其中金雀異黃素(Genistein)生物活性最強(qiáng)。體內(nèi)外研究均證實(shí)大豆異黃酮能減少激素依賴性腫瘤乳腺癌和前列腺癌發(fā)病率,是一種很有前景的防治癌癥的天然化學(xué)物質(zhì)。已知激素替代療法有助于降低絕經(jīng)女性結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),因此開展對植物雌激素的大豆異黃酮在結(jié)腸癌中的防治作用的研究具有重要的意義。另外,作為腫瘤的放射治療在臨床上可聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)、化學(xué)或激素治療,為了提高局部控制以及生存期,放療聯(lián)合放射增敏試

2、劑是一種針對癌癥的有效的治療方法,大豆異黃酮在其中所起的作用也值得關(guān)注。
　　目的：研究大豆異黃酮對結(jié)腸癌和乳腺癌的抗癌作用及大豆異黃酮對結(jié)腸癌和乳腺癌的輻射增敏作用。
　　方法：細(xì)胞株選用人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116和乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-468,細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)傳代。除非特別交代,金雀異黃素的實(shí)驗(yàn)濃度定為0、25、50和100μmol/L。采用MTT法測定細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的分布、Wes

3、tern blot法測定相關(guān)蛋白的表達(dá)、磷脂酰絲氨酸外翻法(Annexin V-PI雙染法)分析金雀異黃素對細(xì)胞凋亡的影響;細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(DCF法)和線粒體膜電位的變化(JC-1法)采用試劑盒檢測;采用透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變;金雀異黃素對腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的影響,采用Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附性實(shí)驗(yàn)以及免疫熒光法測定E-鈣粘附蛋白(E-cadherin)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)的變化進(jìn)行研究。金雀異黃素對腫瘤細(xì)

4、胞放射敏感性的初步研究選用無毒性25μmol/L的金雀異黃素處理細(xì)胞,聯(lián)合 X射線對細(xì)胞進(jìn)行輻照。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞的凋亡、并用Western blot法進(jìn)一步檢測金雀異黃素預(yù)處理對照射后細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：⑴金雀異黃素對HCT-116細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,并呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系,抑制50％細(xì)胞生長的劑量(IC50)為123.8μmol/L(24

5、h)。0、25、50和100μmol/L金雀異黃素處理后出現(xiàn)了明顯的G2/M的周期阻滯,細(xì)胞數(shù)量從18.11±1.36％增至32.7±0.04％。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),金雀異黃素處理降低了細(xì)胞周期蛋白CyclinB1、CyclinH表達(dá),對CylinD3、CyclinA、CyclinE的表達(dá)無明顯影響。⑵金雀異黃素處理HCT-116細(xì)胞后,Annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示早期凋亡細(xì)胞比例隨濃度增加而上升,晚期凋亡細(xì)胞也略有增多。特

6、征性的Sub-G1凋亡峰隨處理濃度的增加而增多。100μmol/L金雀異黃素處理2 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)峰值,為處理前的1.81倍(15.53±1.55％vs8.57±0.35％),然后逐漸下降。100μmol/L金雀異黃素處理1h后線粒體膜電位迅速下降了87.8％,以后雖略有回升,但維持在極低的水平。與凋亡相關(guān)的P53蛋白出現(xiàn)升高,并且抑凋亡蛋白Bcl-2出現(xiàn)了下調(diào),促凋亡蛋白 Bax出現(xiàn)了上調(diào)。透射電鏡下,金雀異黃素處理后細(xì)胞呈現(xiàn)

7、不同程度的凋亡和自噬性改變。⑶100μmol/L金雀異黃素處理8h后細(xì)胞粘附性為81.32±3.26％,對照組為97.31±7.68％,即金雀異黃素顯著降低粘附能力。Transwell結(jié)果顯示0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)分別為567.67±50、407±15.58、63.33±11.15,即侵襲轉(zhuǎn)移能力逐步下降。熒光顯微鏡下100μmol/L金雀異黃素處理后細(xì)胞質(zhì)中E-cadherin熒光強(qiáng)度變強(qiáng),MMP2抗體熒

8、光強(qiáng)度變?nèi)?。⑷金雀異黃素對MDA-MB-468細(xì)胞增殖也有明顯的抑制作用并具有濃度和時(shí)間依賴關(guān)系,IC50為70.8μmol/L(24 h)。0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后G2/M期細(xì)胞數(shù)量從10.04±0.74％增至50.21±1.47％,100μmol/L時(shí)減至19.55±7.13％,表明低濃度時(shí)(<50μmol/L)引起G2/M期阻滯。⑸Annexin V/PI雙染法分析顯示100μmol/L金雀異黃素處理后晚期凋亡細(xì)

9、胞有所增加。特征性的Sub-G1凋亡峰隨著處理濃度的增加而增多。100μmol/L金雀異黃素處理后2 h,ROS水平是處理前的1.44倍(84.8±2.69％vs58.93±0.67％),然后逐漸下降。100μmol/L金雀異黃素處理1h后細(xì)胞線粒體膜電位迅速下降了93.7％(16.03±0.52％ vs1.01±0.20％, P<0.01),以后維持在極低的水平。透射電鏡下,處理后細(xì)胞也呈現(xiàn)不同程度的凋亡性改變。⑹100μmol/L金

10、雀異黃素處理6h后細(xì)胞粘附性為93.45±0.90％,顯著低于對照組的99.21±0.58％。Transwell結(jié)果顯示0、25、50μmol/L金雀異黃素處理后轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)分別為546.33±20.07、449.67±14.38、305.67±8.06,提示侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降。熒光顯微鏡下,100μmol/L金雀異黃素處理后細(xì)胞質(zhì)中 NF-κB抗體熒光強(qiáng)度稍變?nèi)?細(xì)胞質(zhì)中 E-cadherin抗體熒光強(qiáng)度變強(qiáng)、MMP2抗體熒光強(qiáng)度變?nèi)?/p>

11、。⑺在人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中,與單純照射組6Gy組比較,25μmol/L金雀異黃素預(yù)處理照射聯(lián)合組,能明顯減少照射后的細(xì)胞克隆形成數(shù),其放射增敏比為1.204。細(xì)胞周期的結(jié)果顯示25μmol/L金雀異黃素與6Gy輻射聯(lián)合后G2/M期細(xì)胞上升至35.74±3.25％,與單純照射組26.26±2.19％相比有明顯升高。特征性的Sub-G1凋亡峰,單純照射組為:5.25±0.8％,聯(lián)合組為10.89±0.24％。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)金雀異黃素與

12、輻射聯(lián)合較單純照射組比 DNA損傷修復(fù)蛋白 Ku80、Mre11和XRCC4的表達(dá)出現(xiàn)了明顯下調(diào)。⑻在乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中,25μmol/L金雀異黃素與6Gy輻射聯(lián)合組和6Gy照射組的G2/M期細(xì)胞分別為82.41±2.44％和24.08±2.87％,發(fā)現(xiàn)金雀異黃素預(yù)處理能夠明顯引起細(xì)胞G2/M期周期阻滯。特征性的Sub-G1凋亡峰,單純照射組為:7.24±0.68％,聯(lián)合組為13.3±0.74％。但是,在MDA-MB-46

13、8細(xì)胞的Ku80、XRCC4、Mre11蛋白水平無明顯差異。
　　結(jié)論：①金雀異黃素能夠抑制結(jié)腸癌HCT-116和乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的增殖,并呈濃度依賴和時(shí)間依賴。金雀異黃素誘導(dǎo)了這兩種腫瘤細(xì)胞的G2/M期周期阻滯。誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,從而引起線粒體膜電位的降低誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。②其抗腫瘤的作用機(jī)制可能是金雀異黃素能夠下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),上調(diào)促凋亡蛋白 Bax等的表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡,引起細(xì)胞周期蛋白的改變