銀杏黃酮對順鉑所致卵巢功能損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以不同濃度的銀杏黃酮(GBE)干預(yù)順鉑(cisplatin，CDDP)所作用的卵巢顆粒細(xì)胞。四甲基偶氮唑藍(lán)法( MTT)檢測不同濃度的GBE對CDDP所作用的卵巢顆粒細(xì)胞的生長影響?；瘜W(xué)發(fā)光法測定各組細(xì)胞上清液中的雌激素水平，分別測定不同濃度的GBE對CDDP所作用的卵巢顆粒細(xì)胞中超氧化物歧化酶( SOD)活力、丙二醛(MDA)含量，從而探討GBE對CDDP所致卵巢功能損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 1.研究

2、對象
　　 1.1 實(shí)驗(yàn)組：收集2010年4月-2010年10月在我院行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的卵泡液，提取卵巢顆粒細(xì)胞，分為CDDP組(顆粒細(xì)胞中只加入CDDP)和CDDP+GBE組(在加入CDDP的同時分別加入4種不同濃度的GBE)。
　　 1.2 對照組：只含有卵巢顆粒細(xì)胞不添加任何處理因素的陽性對照組。
　　 所選患者共82例，（30.62±2.13歲），被納入的條件為月經(jīng)規(guī)律，基礎(chǔ)體溫雙

3、相，生殖激素水平在正常范圍內(nèi)且無多囊卵巢綜合征及子宮內(nèi)膜異位癥，近6個月無服用激素類藥物及免疫抑制類藥物。
　　 排除：子宮肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等其它婦科腫瘤；內(nèi)分泌、免疫及代謝性疾病；高血壓、心臟病、腎病等內(nèi)科疾病等。按促性腺釋放激素激動劑/促卵泡激素/人絨毛膜促性腺激素長周期方案誘發(fā)排卵。
　　 2.標(biāo)本采集
　　 收集陰道B超引導(dǎo)下后穹窿穿刺抽吸雙側(cè)卵巢的卵泡液于試管中，即刻送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。
　

4、　 3.實(shí)驗(yàn)方法
　　 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)卵泡液經(jīng)離心、漂洗、分離、消化。接種于6孔培養(yǎng)板中，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去未貼壁細(xì)胞及紅細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。
　　 24h鏡下觀察，細(xì)胞長滿90％板壁時，吸去培養(yǎng)基，Hands液沖洗，棄去未貼壁細(xì)胞和紅細(xì)胞。0.25％胰蛋白酶室溫下消化，鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓時，加入Hands液終止消化，

5、繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 3.2 CDDP對顆粒細(xì)胞生長影響的MTT實(shí)驗(yàn)分別取CDDP濃度0、2.5、5、7.5、10ug/ml作用于卵巢顆粒細(xì)胞，48h后酶聯(lián)免疫檢測儀測定細(xì)胞吸光度值（OD值），計算細(xì)胞抑制率，取細(xì)胞抑制率達(dá)30％以上的CDDP濃度10ug/ml，為以下實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。3.3 CDDP與不同濃度的GBE合用對顆粒細(xì)胞生長影響的MTT實(shí)驗(yàn)CDDP與不同濃度的GBE分別同時加入，每一濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)空白組，培養(yǎng)48h測定

6、OD值。3.4收集細(xì)胞培養(yǎng)48h后的細(xì)胞上清液，并收集吸去上清液后的顆粒細(xì)胞，化學(xué)發(fā)光法測定各組細(xì)胞上清液中的雌激素水平。3.5將上述收集的顆粒細(xì)胞按照SOD、MDA試劑盒要求取上清液測定各管OD值，BCA法測定各組細(xì)胞中蛋白的含量，計算細(xì)胞中SOD活力、MDA含量。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞生長情況顆粒細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活性90％以上。倒置顯微鏡下觀察，接種細(xì)胞呈圓形，6h后即開始貼壁，24h后基本貼壁完全并

7、開始生長。
　　 2.藥物對顆粒細(xì)胞的生長影響
　　 2.1 CDDP對顆粒細(xì)胞生長的影響CDDP對顆粒細(xì)胞生長的抑制作用呈劑量依賴性即CDDP濃度越大OD值越小。隨著藥物濃度的增加，對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，。
　　 2.2 CDDP與不同濃度的GBE合用對顆粒細(xì)胞的生長影響CDDP與GBE175、225、275、325ug/ml分別同時加入比較CDDP+GBE175ug/ml組比CDDP+GBE225ug/m

8、l組顯著抑制細(xì)胞生長，CDDP+GBE225ug/ml組比CDDP+GBE275ug/ml組顯著抑制細(xì)胞生長，CDDP+GBE275ug/ml組CDDP+GBE325ug/ml組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 隨著GBE濃度的增加，對細(xì)胞的抑制作用逐漸減弱。但達(dá)到一定濃度以后，變化趨勢不再增加。
　　 2.3 CDDP組與CDDP加入不同濃度的GBE合用組對顆粒細(xì)胞生長影響的比較CDDP組與CDDP+GBE175ug/ml比

9、較CDDP組比CDDP+GBE175ug/ml組顯著抑制細(xì)胞生長。
　　 CDDP組與CDDP+GBE225ug/ml比較CDDP組比CDDP+GBE225ug/ml組顯著抑制細(xì)胞生長。
　　 CDDP組與CDDP+GBE275ug/ml比較CDDP組比CDDP+GBE275ug/ml組顯著抑制細(xì)胞生長。
　　 CDDP組與CDDP+GBE325ug/ml比較CDDP組比CDDP+GBE325ug/ml組顯著抑制

10、細(xì)胞生長。
　　 與空白對照組相比，CDDP組和CDDP+GBE組與空白對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.雌激素水平的測定比較CDDP組與CDDP加入不同濃度GBE組細(xì)胞上清液中雌激素水平比較CDDP組的雌激素水平低于CDDP+GBE組，但與CDDP+GBE175ug/ml組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CDDP組與CDDP+GBE225、275、325ug/ml組的雌激素水平比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CDD

11、P+GBE225、275、325ug/ml組各組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 與空白對照組相比，CDDP組和CDDP+GBE組與空白對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.CDDP組與CDDP加入不同濃度GBE組細(xì)胞中抗氧化水平的比較
　　 4.1 CDDP組與CDDP+GBE175、225、275、325ug/ml組細(xì)胞中SOD活力的比較CDDP組與CDDP+GBE175、225、275、325ug/ml組分別比較均有

12、統(tǒng)計學(xué)意義。CDDP+GBE175ug/ml組與CDDP+GBE225、275、325ug/ml組之間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。CDDP+GBE225、275、325ug/ml各組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 與空白對照組相比，CDDP組和CDDP+GBE組與空白對照組SOD活力比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.2 CDDP組與CDDP+GBE175、225、275、325ug/ml組細(xì)胞中MDA含量的比較CDDP組與CDDP+GB

13、E175、225、275、325ug/ml組MDA含量比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CDDP+GBE275ug/ml與CDDP+GBE325ug/ml比較無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 與空白對照組相比，CDDP組和CDDP+GBE組與空白對照組MDA含量比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.CDDP能顯著抑制體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞的增值，呈劑量依賴性。
　　 2.CDDP+GBE組對體外培養(yǎng)的卵巢顆

14、粒細(xì)胞的抑制作用低于單用CDDP組，且隨著GBE濃度增加其抑制作用逐漸減弱。但達(dá)到一定濃度后，變化趨勢不再增加。
　　 3.CDDP+GBE組的雌激素水平高于CDDP組，但加入GBE小劑量組與CDDP組差異無顯著性。隨GBE加入濃度增加雌激素水平逐漸增加，但達(dá)到一定濃度后差異無顯著性。
　　 4.CDDP+GBE組對顆粒細(xì)胞的抗氧化水平高于CDDP組，當(dāng)GBE加入濃度達(dá)到一定程度以后，各組間的變異不再明顯。