幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)基因的分段表達(dá)及免疫學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、目的：
　　 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)與多種胃部疾病密切相關(guān),在多種胃腸外疾病中也起作用,國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)已將其列為Ⅰ類致癌因子。H.pylori在全球感染率近50％,在發(fā)展中國家,可高達(dá)80％以上。目前針對H.pylori感染的聯(lián)合療法(抗生素聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑)存在明顯不足:醫(yī)療費(fèi)用高、較低的患者依從性、易產(chǎn)生耐藥性、不能徹底根除細(xì)菌、不能防止再感染。H.pylori疫苗接種有助于

2、H.pylori相關(guān)性疾病的發(fā)病率。
　　 目前所研究的H.pylori治療性疫苗大多采用H.pylori全菌或全菌裂解物,或H.pylori毒性蛋白如尿素酶、空泡毒素、毒素相關(guān)蛋白、中性粒細(xì)胞激活蛋白等,單獨(dú)或聯(lián)合不同佐劑進(jìn)行接種,在動(dòng)物模型中均能引起保護(hù)性應(yīng)答。
　　 尿素酶是H.pylori中含量最為豐富的蛋白,既是H.pylori的定植因子又是毒力因子,并且在各菌株中相對保守,其B亞單位(LlreB)以其無毒性成

3、為疫苗設(shè)計(jì)的首選保護(hù)性抗原。在宿主體內(nèi),蛋白抗原主要是通過表位發(fā)揮作用的,蛋白抗原引起的細(xì)胞反應(yīng)主要是由免疫優(yōu)勢表位引起的特異性的細(xì)胞反應(yīng),因此,明確UreB蛋白抗原的表位,特別是優(yōu)勢表位,利于發(fā)展更有效的H.pylori疫苗。
　　 本課題旨在用基因工程方法分段表達(dá)UreB蛋白,并對其進(jìn)行免疫學(xué)性質(zhì)分析,獲得有免疫學(xué)活性的UreB片段;用H.pylori全菌皮下免疫C57BL/6小鼠,借助DC2.4細(xì)胞的抗原遞呈作用,建立體外

4、篩選UreB優(yōu)勢表位的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,為精確篩選UreB優(yōu)勢表位奠定方法學(xué)基礎(chǔ),此研究將為制備高效的表位疫苗提供理論指導(dǎo)。
　　 方法
　　 1.用DNASTAR和DeepView/Swiss-Pdb Viewer3.7(SP5)軟件分析UreB結(jié)構(gòu)和全基因序列,以覆蓋該蛋白全長、不遺漏表位為原則,選擇UreB全基因序列的分割點(diǎn),設(shè)計(jì)UreB五個(gè)截?cái)嗥蜺1(1～185aa)、U2(98～294aa)、U3(179～38

5、0aa)、U4(292～476aa)和U5(375～569aa)。
　　 2.以本室前期獲得的重組UreB為模板,采用PCR方法擴(kuò)增U1、U2、U3、U4和U5五個(gè)片段,并構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-11c(+)中,通過NdeⅠ/EcoRⅠ酶切鑒定陽性重組子,構(gòu)建PET-11c-U1、PET-11c-U2、PET-11c-U3、PET-11c-U4和PET-11c-U5五個(gè)重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)對比。

6、r>　　 3.將PET-11c-U1、pET-11c-U2、pET-11c-U3、pET-11c-U4和pET-11c-U5五個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá),免疫印跡鑒定其抗原性。
　　 4.用初步純化的重組片段U1、U2、U3、U4和U5以100μg/只/次口服免疫BALB/C小鼠,同時(shí)做PBS組對照,抗原加弗氏完全佐劑(1:1)乳化初次免疫后,間隔一周加弗

7、氏不完全佐劑(1:1)再次免疫三次。末次免疫7天后,ELISA檢測免疫后抗血清,鑒定重組片段的免疫原性。
　　 5.在體外鑒定C57BL/6小鼠細(xì)胞的Th1型細(xì)胞應(yīng)答:用H.pylori超聲破碎物以100μg/只/次皮下免疫不同性別C57BL/6小鼠,抗原加弗氏完全佐劑(1:1)乳化初次免疫后,間隔一周加弗氏不完全佐劑(1:1)再次免疫三次。于末次免疫7天后取小鼠淋巴結(jié)及脾臟,分別分離其淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞。用PMA和離子霉素聯(lián)合

8、刺激分離出的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測其中分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例。
　　 6.為消除胰酶對DC2.4細(xì)胞的影響,未用胰酶處理DC2.4細(xì)胞,倒置顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)測定DC2.4細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表達(dá)水平。
　　 7.為優(yōu)化DC2.4細(xì)胞的抗原遞呈效果,確定DC2.4細(xì)胞負(fù)載抗原并成熟的最佳條件:用UreB聯(lián)合LPS及TNF-α刺激DC2.4細(xì)胞,于培養(yǎng)的不

9、同時(shí)間收集DC2.4細(xì)胞懸液,測定DC2.4細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表達(dá)率,獲得負(fù)載UreB抗原的成熟的DC2.4細(xì)胞。
　　 8.為獲得大量的UreB特異性的T細(xì)胞,在體外,負(fù)載UreB的成熟的DC2.4細(xì)胞與H.pylori免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞分別以1:1、1:2、1:5的比例混合培養(yǎng),96孔板每孔含1×105個(gè)脾淋巴細(xì)胞,終體積為200μL,在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后,再添加I

10、L-2(100 U/mL,),繼續(xù)培養(yǎng)2 d后收集細(xì)胞懸液。
　　 9.為了確定混合細(xì)胞應(yīng)答的的最適比例,將UreB特異性的T細(xì)胞與負(fù)載UreB的成熟的DC2.4細(xì)胞分別以1:1、1:2、1:5的比例混合培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)測定分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)果
　　 1.成功克隆了U1(1～185aa)、U2(98～294aa)、U3(179～380aa)、U4(292～476aa)和U5(375～

11、570aa)5個(gè)目的片段,成功構(gòu)建了PET-11c-U1、PET-11c-U2、PET-11c-U3、PET-11c-U4和PET-11c-U5五個(gè)重組質(zhì)粒;經(jīng)測序所得產(chǎn)物基因序列與Genbank數(shù)據(jù)相符。
　　 2.將PET-11c-U1、PET-11c-U2、PET-11c-U3、PET-11c-U4和PET-11c-U5五個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸桿菌BL21(DE3),IPTG作用4h誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE顯示

12、,重組蛋白U1、U2、U3、U4和U5均在大腸桿菌E.coli BL21中成功表達(dá),誘導(dǎo)出的蛋白分子量分別約為20.0kDa、21.0kDa、22.0kDa、21.0kDa和22.0kD;免疫印跡和ELISA顯示五個(gè)重組片段均具有良好的抗原性和免疫原性。
　　 3.用PMA聯(lián)合離子霉素刺激分離出的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示雄性C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞組分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例最高。
　　

13、4.流式細(xì)胞術(shù)測定DC2.4細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表達(dá)水平,顯示胰酶消化后DC2.4細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子呈低水平表達(dá)而協(xié)同刺激分子CD86呈高水平表達(dá);而未用胰酶處理的DC2.4細(xì)胞MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD86的表達(dá)水平均較低。
　　 5.UreB負(fù)載DC2.4細(xì)胞24h,加入LPS及TNFα繼續(xù)刺激12h,DC2.4細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子的表達(dá)均處于較高水平,獲得了負(fù)載UreB的成熟的D

14、C2.4細(xì)胞。
　　 6.通過流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平,確定了混合細(xì)胞反應(yīng)的最適比例:在體外,負(fù)載UreB的成熟的DC2.4細(xì)胞與H.pylori免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞以1:2的比例混合培養(yǎng),培養(yǎng)的第7天可獲得大量的UreB特異性的T細(xì)胞,將載UreB的成熟的DC2.4細(xì)胞與該UreB特異性的T細(xì)胞負(fù)再以1:2的比例共培養(yǎng),細(xì)胞群中分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例最高。
　　 結(jié)論