胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)下丘腦神經(jīng)元鈣信號(hào)的調(diào)節(jié)及機(jī)制.pdf

1、下丘腦是神經(jīng)-內(nèi)分泌兩大機(jī)能系統(tǒng)的結(jié)合點(diǎn)，整合、處理體內(nèi)大量生長(zhǎng)信號(hào)和代謝信號(hào)，在維持機(jī)體正常生命活動(dòng)和內(nèi)環(huán)境恒定中發(fā)揮重要的作用。研究表明機(jī)體衰老過(guò)程中，首先會(huì)出現(xiàn)內(nèi)分泌功能的紊亂，因此有學(xué)者認(rèn)為下丘腦在調(diào)節(jié)衰老的進(jìn)程中起著重要作用。衰老的鈣失衡假說(shuō)認(rèn)為，衰老伴隨有神經(jīng)元胞漿內(nèi)鈣離子濃度（[Ca2+]I）穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的失調(diào)，衰老可通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)元[Ca2+]I異常升高，這些內(nèi)鈣調(diào)節(jié)機(jī)制的異常又進(jìn)一步影響突觸傳遞、遞質(zhì)釋放和信號(hào)轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)過(guò)程，促進(jìn)衰老的發(fā)展。
　　 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-like growth factor-1，IGF-1）與IGF-2、胰島素具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，參與調(diào)節(jié)糖、能量代謝和生長(zhǎng)。IGF-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。已有研究顯示，IGF-1能影響下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能。下丘腦弓狀核的神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y，NPY)神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)代謝、生長(zhǎng)、生殖和食欲。IGF-

3、1可通過(guò)作用于NPY神經(jīng)元（影響NPY的合成和釋放），發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。鈣離子在調(diào)節(jié)細(xì)胞活性、激素的合成與釋放中扮演著重要角色，而IGF-1對(duì)下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，特別是對(duì)電壓依賴性鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞在一定程度上可以反映在體細(xì)胞的衰老、退化過(guò)程。因此本研究用長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元，模擬神經(jīng)元發(fā)育、成熟與

4、衰老的全過(guò)程，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化的鑒定，研究生理濃度的IGF-1對(duì)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的下丘腦NPY神經(jīng)元VGCCs的調(diào)節(jié)作用及其這種作用的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGF-1預(yù)孵育24小時(shí)能顯著增加NPY神經(jīng)元的高電壓激活鈣電流（high voltage-activated calcium currents，IHVA）的幅值，這種增強(qiáng)作用能被磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylino 3-kinase，PI3-K）的

5、抑制劑所阻斷，而且L-型鈣通道的阻斷劑nifedipine也能明顯抑制這種作用。IGF-1的這種調(diào)節(jié)作用在培養(yǎng)的中期較早期和后期明顯。激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示IGF-1可使NPY神經(jīng)元上L-型鈣通道的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明IGF-1通過(guò)激活PI3-K增加NPY神經(jīng)元的IHVA，其中L-型鈣通道是介導(dǎo)IGF-1神經(jīng)元調(diào)節(jié)作用的主要鈣通道亞型，鈣通道表達(dá)的變化可能參與了IGF-1的作用。
　　 第一部分：IGF-1對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)

6、間的下丘腦NPY神經(jīng)元電壓依賴性鈣電流的作用
　　 目的：在衰老的神經(jīng)-內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)中，認(rèn)為下丘腦是衰老的起步點(diǎn)。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞在一定程度上反映在體細(xì)胞的衰老、退化過(guò)程。IGF-1和NPY都能調(diào)節(jié)代謝、生殖并有神經(jīng)保護(hù)作用。IGF-1可通過(guò)影響NPY的合成及釋放，調(diào)節(jié)下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)衰老進(jìn)程。VGCCs在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮著重要作用。在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了生理濃度的IGF-1對(duì)下丘腦

7、NPY神經(jīng)元IHVA的作用以及這種作用與體外培養(yǎng)時(shí)間之間的關(guān)系。
　　 方法：(1)采用免疫組化的方法鑒定下丘腦NPY神經(jīng)元。(2)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及記錄后的再次鑒定比對(duì)，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察IGF-1對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的下丘腦NPY神經(jīng)元IHVA的作用。
　　 結(jié)果：(1)NPY神經(jīng)元在形態(tài)上具有明顯的特點(diǎn)，典型的NPY神經(jīng)元細(xì)胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個(gè)細(xì)小的、不分枝的一級(jí)樹(shù)突。(2)IGF-1能增加

8、各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期的NPY神經(jīng)元的IHVA，其調(diào)節(jié)作用在培養(yǎng)中期（DIV 7d和14d）最大，培養(yǎng)的早期和晚期，調(diào)節(jié)作用均明顯降低。
　　 結(jié)論：IGF-1對(duì)VGCCs的抑制或活化能調(diào)節(jié)相應(yīng)神經(jīng)元的興奮性及功能，這可能是IGF-1神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之一。
　　 第二部分：IGF-1對(duì)下丘腦NPY神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道的作用及其機(jī)制
　　 目的：下丘腦NPY神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)代謝、生長(zhǎng)、生殖和食欲。IGF-1可通過(guò)作用

9、于NPY神經(jīng)元（影響其合成和釋放），而發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。VGCCs在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中發(fā)揮著重要作用。在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步觀察生理濃度的IGF-1對(duì)體外培養(yǎng)7d的NPY神經(jīng)元VGCCs的作用，并探討IGF-1調(diào)控這類神經(jīng)元VGCCs的機(jī)制。
　　 方法：(1)采用免疫組化方法鑒定NPY神經(jīng)元。(2)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及記錄后的再次鑒定比對(duì)，進(jìn)一步觀察IGF-1對(duì)體外培養(yǎng)7d的NPY

10、神經(jīng)元VGCCs的作用并探討其信號(hào)調(diào)節(jié)通路。(3)應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光雙標(biāo)方法，觀察IGF-1對(duì)NPY神經(jīng)元上鈣通道表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：(1)NPY神經(jīng)元在形態(tài)上具有明顯特點(diǎn)，典型的NPY神經(jīng)元細(xì)胞體較小，成三角形或紡錘形，大部分具有1-3個(gè)細(xì)小的、不分枝的一級(jí)樹(shù)突。(2)IGF-1增加NPY神經(jīng)元的IHVA，使穩(wěn)態(tài)激活曲線稍向超級(jí)化方向移動(dòng)，但不改變穩(wěn)態(tài)失活曲線。IHVA的增加能被PI3-K的抑制劑明顯減弱，而且可被L