胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)高氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞抗凋亡機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1、研究IGF-1對(duì)高氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞周期的影響。
　　2、研究IGF-1對(duì)A549細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2及caspase-3表達(dá)的影響。
　　方法：
　　l、A549細(xì)胞株傳代培養(yǎng)。
　　2、分組：Ⅰ組：正常組，Ⅱ組:高氧組，Ⅲ組：高氧+IGF-1低劑量組，Ⅳ組：高氧+IGF-1中劑量組，Ⅴ組：高氧+IGF-1高劑量組等5組。
　　3、A549細(xì)胞高氧處理及藥物干預(yù)：放入CO2

2、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞融合至40-50％時(shí)，進(jìn)行IGF-1藥物干預(yù)。
　?。?）Ⅱ組（高氧組）：細(xì)胞用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液放入氧濃度85%的封閉箱內(nèi)放入5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h；
　　（2）藥物干預(yù)組：將Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組細(xì)胞用不同劑量IGF-1處理，與高氧組一同放入氧濃度85%封閉箱內(nèi)，再放入5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h；
　?。?）Ⅰ組（

3、正常組）：細(xì)胞用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　4、觀察指標(biāo)：①采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；
　　②采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；
　?、跦E染色觀察細(xì)胞的凋亡情況；
　?、懿捎昧魇郊?xì)胞儀AnnexinⅤ-PI熒光雙染法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；
　　⑤免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)變化。
　　⑥采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)bax、bcl-2表達(dá)的水平。
　　

4、5、統(tǒng)計(jì)學(xué)資料處理方法：
　　計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x士s)來(lái)表示，應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)資料服從近似正態(tài)分布，組間比較利用單因素方差分析。P<0.05表明有顯著性的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞存活率測(cè)定：與Ⅰ組相比，Ⅱ組A549細(xì)胞的存活率明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組OD值無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而Ⅳ、Ⅴ組

5、OD值隨著IGF-l藥物濃度的遞增逐漸增大，細(xì)胞存活率逐漸升高，與Ⅱ組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、細(xì)胞周期分析：與Ⅰ組相比，Ⅱ組A549細(xì)胞S、G2-M期的細(xì)胞百分比下降，差異均有顯著性意義(P

6、義(P<0.05)；G0-G1和G2-M期細(xì)胞百分比在不同劑量IGF-Ⅰ組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但是S期細(xì)胞百分比在不同劑量IGF-Ⅰ組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性效應(yīng)。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：利用AnnexinⅤ-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果Ⅱ組凋亡率較Ⅰ組明顯增多，差異有顯著性意義(P

7、大，其細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性降低，差異有顯著性意義（P<0.05)。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)情況：與Ⅰ組相比，Ⅱ組A549細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)水平下降，Bax的表達(dá)水平升高，差異均有顯著性意義（p<0.05)；與高氧組相比，藥物干預(yù)組A549細(xì)胞的Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯增高，而B(niǎo)ax的表達(dá)下降，差異均有顯著性意義（P　　

8、5、免疫細(xì)胞化學(xué)法分析Caspase-3蛋白表達(dá)：與Ⅰ組相比，Ⅱ組A549細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度增高(P　　結(jié)論：
　　1、高氧明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。
　　2、IGF-1參與高氧誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致G1期細(xì)胞減少，S期以及G2期細(xì)胞增多，并在S期的調(diào)節(jié)上存在劑量依