前列腺特異性膜抗原新型剪接變異體PSM-E的外周血定量表達(dá)檢測(cè)分析及其臨床意義探討.pdf

1、研究背景和目的： 前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是歐美國(guó)家最常見的男性惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌居第二位。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率近年來(lái)呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)。由于多數(shù)前列腺癌發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀輕微，當(dāng)癥狀發(fā)生時(shí)多數(shù)已有局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，晚期PCa治療效果欠佳。如何早期、準(zhǔn)確的診斷前列腺癌以便早期及時(shí)治療日益受到重視。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一些敏感性高、特異性強(qiáng)與PCa相關(guān)的指標(biāo)診斷PCa是關(guān)注的焦點(diǎn)。

2、目前臨床上應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記物前列腺特異性抗原(prostate—specific antigen，PSA)是一個(gè)組織特異性而非腫瘤特異性的標(biāo)記物。前列腺特異性膜抗原(prostate—specific membrane antigen，PSMA)作為與前列腺癌密切相關(guān)的細(xì)胞跨膜蛋白，是近年來(lái)前列腺癌研究的熱點(diǎn)。PSMA僅為人正常、惡性及轉(zhuǎn)移灶的前列腺細(xì)胞所表達(dá)，具有很高的前列腺組織特異性。研究者發(fā)現(xiàn)PSMA在正常前列腺組織的表達(dá)很少，在

3、前列腺增生及前列腺癌中表達(dá)增強(qiáng)，且尤以前列腺癌表達(dá)最高，逐漸認(rèn)識(shí)到PSMA比PSA更具有特異性，并在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)它可用于早期診斷前列腺癌及其轉(zhuǎn)移癌，以及前列腺癌術(shù)后的檢測(cè)。 大量組織學(xué)研究結(jié)果證實(shí)了PSMA對(duì)于前列腺癌的高特異性，但血液學(xué)檢測(cè)方面存在爭(zhēng)議，因健康人中也可測(cè)到血清PSMA且隨著年齡增長(zhǎng)濃度升高，特別是50歲以后升高更明顯，并且健康女性血清PSMA也隨年齡增長(zhǎng)而升高及乳腺癌患者血清PSMA水平增高，認(rèn)為PSMA并

4、非PCa的特異性生物標(biāo)記，許多正常及疾病組織與血清PSMA水平相關(guān)。在腫瘤的早期階段就有癌細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，運(yùn)用高靈敏度的方法檢測(cè)外周血中的PSMA mRNA的表達(dá)將有助于PCa血行播散的判斷及早期診斷。RT—PCR法可檢測(cè)出外周血中少量的mRNA，具有較高靈敏度，可用于PCa的早期診斷。這方面的研究同樣存在爭(zhēng)議，有許多研究證實(shí)PSMAmRNA檢測(cè)的真實(shí)性和可靠性明顯優(yōu)于PSA，其特異性和敏感性更高，同樣也有研究發(fā)現(xiàn)PSMAmRNA在健康

5、人中的假陽(yáng)性率達(dá)38％，認(rèn)為在PCa的診斷中其臨床效用低，需另行設(shè)計(jì)特異性引物及定量分析區(qū)分循環(huán)中的前列腺細(xì)胞。 PSMA存在可變剪接現(xiàn)象，通過(guò)可變剪接可以改變?cè)械鞍椎墓δ?，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。PSM—E是前期在為進(jìn)行基因重組PSMA前列腺癌疫苗的研究中，本研究組首次在世界上發(fā)現(xiàn)的一種PSMA新型剪接變異體，基因序列分析及編碼蛋白預(yù)測(cè)分析表明，PSM—E不同于PSMA及目前已報(bào)導(dǎo)的其它剪接變異體，其基因序列編

6、碼的蛋白可能完全是一種新的細(xì)胞跨膜蛋白。而此前已發(fā)現(xiàn)的剪接變異體PSM’、PSM—C、PSM—D則均位于細(xì)胞漿，缺少蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白，缺乏PSMA原有的生物學(xué)功能及對(duì)前列腺癌診斷和治療時(shí)的靶細(xì)胞定位作用。 前期研究中我們發(fā)現(xiàn)在腎、膀胱、十二指腸、回腸、肝癌及乳腺癌腫瘤組織中可檢測(cè)到PSMA mRNA的轉(zhuǎn)錄物，但新剪接變異體PSM—E則僅在PCa和LNCaP中檢測(cè)到，PSM—E僅表達(dá)于前列腺癌而在其它器官中缺如；PS

7、M—E mRNA水平在正常前列腺、BPH和PCa間有顯著性差異，并且PSM—E水平隨Gleason評(píng)分一起升高。這證明PSM—E是一種較PSMA特異性更高的前列腺標(biāo)記物，組織PSM—E mRNA表達(dá)水平可用于區(qū)分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌。 既往已有研究證實(shí)外周血PSMA檢測(cè)對(duì)PCa的診斷較PSA特異性更高，那么對(duì)于剪接變異體PSM—E來(lái)說(shuō)，PSM—E在PCa和BPH患者的外周血中是否表達(dá)？其表達(dá)水平是否如同組織學(xué)研究一樣

8、存在差異？能否通過(guò)高靈敏度的方法檢測(cè)其差異而診斷PCa患者？這些都是本論文要研究的問(wèn)題。 在此前我們的系列性相關(guān)研究基礎(chǔ)成果上，本課題擬進(jìn)一步研究外周血PSM—E檢測(cè)分析在前列腺良、惡性疾病中的意義。因此，本研究根據(jù)獲得的PSM—E編碼區(qū)基因序列，制備PSM—E的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/PSM—E，根據(jù)PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D cDNA序列，設(shè)計(jì)PSM—E、PSMA特異性引物；定量分析PSM—

9、E mRNA在正常對(duì)照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表達(dá)水平，并分析其差異，以證實(shí)PSM—E在前列腺癌患者外周血中的高表達(dá)特異性。為尋找前列腺癌靈敏和特異的診斷指標(biāo)提供新的思路和理論依據(jù)。 方法： 1.PSM—E/PSMA的特異性引物及真核表達(dá)載體的制備： 前列腺癌組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PSMA的基因序列設(shè)計(jì)含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增cDNA；PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)

10、載體pcDNA3.0分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑選并鑒定氨芐青霉素抗性的陽(yáng)性克隆增菌測(cè)序。提取LNCaP、PC—3細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PSM—E、PSMA、PSM’、PSM—C和PSM—D結(jié)構(gòu)序列特征設(shè)計(jì)PSM—E、PSMA特異性引物以區(qū)分其它剪接變異體，并構(gòu)建PSM—E及PSMA的真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)。 2.PCA、B

11、PH及正常對(duì)照者外周血PSM—E/PSMA熒光定量PCR檢測(cè)及分析： 選取臨床前列腺癌(n=53)、前列腺增生(n=79)患者及正常對(duì)照者(n=19)，提取其外周血有核細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別利用PSM—E、PSMA特異性引物，熒光定量PCR檢測(cè)PSM—E、PSMA mRNA在正常對(duì)照、前列腺增生、前列腺癌患者外周血中的表達(dá)水平，以PSM—E/PSMA質(zhì)粒作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，以β—actin質(zhì)粒作為內(nèi)參進(jìn)行校正，對(duì)檢測(cè)

12、結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析其差異及探討其臨床意義。 結(jié)果： 1.成功制備PSM—E、PSMA的真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.0/PSM—E和pcDNA3.0/PSMA)及內(nèi)參β—actin質(zhì)粒，設(shè)計(jì)了PSM—E及PSMA的特異性引物； 2.外周血PSMA表達(dá)在PCa、BPH及正常對(duì)照三組間存在差異，方差分析跟獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCa組的均值比正常組低同時(shí)比BPH組高。PSMA相對(duì)表達(dá)量在PCa組(-12.51±0.31

13、)高于BPH組(-13.72±0.48)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。 3.外周血PSM—E表達(dá)在PCa、BPH及正常對(duì)照三組之間存在差異，方差分析跟獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCa組的表達(dá)高于正常對(duì)照及BPH組。PSM—E相對(duì)表達(dá)量在PCa組(—8.22±0.32)高于BPH組(—9.99±0.41)，P<0.001。 4.PCa組內(nèi)PSM—E表達(dá)高于PSMA，差值均數(shù)—4.29，P<0.001；BPH組內(nèi)PSM

14、—E表達(dá)同樣高于PSMA，差值均數(shù)—3.73，P<0.001。組內(nèi)PSMA與PSM—E相對(duì)表達(dá)量分別相關(guān)(r=0.36，p<0.05；r=0.65，p<0.01)，與血清PSA均不相關(guān)。ROC曲線分析表明PSME在診斷PCa的敏感性、特異性方面要優(yōu)于PSMA。 結(jié)論： 1.PSMA的外周血表達(dá)在PCa、BPH及正常對(duì)照三組間存在差異，但PCa組的均值比正常組低同時(shí)比BPH組高。外周血PSMA檢測(cè)可用于區(qū)分PCa和BPH患