前列腺特異性抗原啟動子-增強子重組質粒篩選及特異性的體外鑒定.pdf

1、目的:利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術從人類基因組DNA中分別擴增PSA啟動子(prostate-specific antigen promoter, PSAP)和增強子(prostate-specific antigen enhancer, PSAE)片段,將擴增的PSA啟動子/增強子片段分別克隆入熒光素酶報告基因載體pTAL-Luc,并構建三組含不同調控序列的重組質粒PSAP1-Luc,PSAP2-Luc以及PSAE-Luc,將重組

2、質粒轉染入三株不同癌細胞后分別定量檢測熒光素酶基因表達情況,以優(yōu)選具有最強調控基因表達活性的啟動子/增強子片段并驗證其組織特異性。
　　方法:參照美國NCBI Nucleotide獲得的序列(U37672.1),利用Primer Premier5.0軟件設計PSA啟動子和增強子的擴增引物;采用PCR技術分別擴增三個PSA啟動子/增強子片段,將擴增出的PSA啟動子/增強子片段通過酶切反應分別與熒光素酶報告基因載體 pTAL-Luc連

3、接得到三組重組質粒。將三組重組質粒分別和內參照β-半乳糖甘酶共轉染入三株癌細胞,前列腺癌細胞(PC-3)、宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MCF-7)中,每組重復三次。利用生物化學發(fā)光儀及多功能酶標儀分別定量測出熒光素酶活性數值(L值)與β-半乳糖甘酶吸光度值(G值),并計算出兩者之間的比值即L/G值,所得的L/G值反映三組重組質粒轉染三株不同癌細胞中的熒光素酶基因表達情況,從而篩選出調控外源基因表達最強的PSA啟動子/增強子序列并

4、同時進行組織特異性的驗證。
　　結果:利用設計好的三對PSA啟動子/增強子引物經PCR技術成功擴增出PSAP1片段(537 bp),PSAP2片段(620 bp)和PSAE片段(1.4 kb);將三個目的基因片段克隆入熒光素酶報告基因載體pTAL-Luc,成功構建出三組重組質粒PSAP1-Luc, PSAP2-Luc和 PSAE-Luc;三組重組質粒分別與內參照β-半乳糖甘酶共轉染入三株癌細胞結果顯示:前列腺癌細胞(PC-3)中所

5、測得的熒光素酶數值與β-半乳糖苷酶的比值(L/G值)最大,比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);PSAP2-Luc在三組重組質粒中測得的熒光素酶數值與β-半乳糖苷酶的比值最大,比較差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　結論:對三組重組質粒轉染入三株不同癌細胞的熒光素酶活性評價:前列腺癌細胞(PC-3)中表達的熒光素酶活性高于宮頸癌細胞(Hela)和乳腺癌細胞(MCF-7),表明PSA啟動子/增強子調控基因表達具有前列腺組織特異性

6、;PSA啟動子和增強子均可調控熒光素酶基因表達,而以包含620 bp長度的PSAP2啟動子調控的熒光酶基因表達活性最強,其為本實驗篩選出的最優(yōu)長度的PSA啟動子序列;篩選出的最優(yōu)長度PSA啟動子將為開展多模態(tài)成像監(jiān)測組織特異性PSA啟動子調控表達基因編輯工具--轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)剪切雄激素受體治療前列腺癌的可行性研究