番茄高可溶性固形物種質(zhì)的創(chuàng)造及相關(guān)基因的差異表達研究.pdf

1、果實可溶性固形物含量是番茄(Lycopeersicumesculentum。Mill)重要的品質(zhì)性狀之一，其含量的高低對番茄果實的營養(yǎng)價值、風(fēng)味口感、實質(zhì)產(chǎn)量等方面有著重要的影響，并且在植株耐冷抗逆、果實儲藏、運輸過程中的防凍等方面亦有重要作用。 利用野生番茄中提高果實可溶性固形物含量的基因?qū)τ诠麑嵠焚|(zhì)改良具有重要意義。為此國內(nèi)外研究者展開了廣泛的研究，已從野生番茄中鑒定了38個與果實可溶性固形物有關(guān)的QTL，并建立了主效QTL

2、的近等基因系(QTL-NILs)和亞近等基因系(sub-NILs)，例如TA1218就是野生多毛番茄LA1777的一個漸參系，其以普通番茄E6203為遺傳背景含有1個長1。2cM來自LA1777第1染色體底端的片段，QTL分析表明該片段具有明顯提高果實可溶性固形物含量的作用。 本研究在前人研究工作的基礎(chǔ)上，以TA1218及其回交后代為主要材料，進行分子標(biāo)記輔助選擇以及篩選優(yōu)秀育種種質(zhì)的研究，并利用cDNA-AFLP方法研究了提高

3、果實可溶性固形物QTL的材料在果實不同發(fā)育階段基因的差異性表達。目的在于：利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)手段將目的基因?qū)氲浆F(xiàn)有栽培骨干系中，消除不良基因的影響，創(chuàng)造新的育種種質(zhì)資源；通過基因差異性表達鑒定和分離與果實可溶性固形物相關(guān)的TDF以及進行生物信息學(xué)分析，研究相關(guān)基因在不同發(fā)育階段的表達情況和功能信息，并初步探討果實可溶性固形物積累的機制。主要結(jié)果如下： (1)對4個RFLP標(biāo)記進行了CAPS標(biāo)記轉(zhuǎn)化分析，其中TG161和T

4、G237成功轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記，表明RFLP標(biāo)記可以轉(zhuǎn)化為易于操作、效率高、成本低的CAPS標(biāo)記。研究結(jié)果對于番茄的快速遺傳分析，特別是在分子育種中對大量材料進行遺傳鑒定時具有較大的應(yīng)用價值。 (2)利用72對EcorI/MseI引物對TA1218、E6203及其F1代進行了AFLP引物篩選，沒有篩選到符合多態(tài)性要求的AFLP引物。 (3)利用2個CAPS標(biāo)記TG161和TG237對TA1218和9706的BC1群體進行

5、分子標(biāo)記分析，并結(jié)合每個單株的可溶性固形物含量進行標(biāo)記型和表現(xiàn)型統(tǒng)計分析。TG161和TG237兩個CAPS標(biāo)記與高可溶性固形物基因緊密連鎖，選擇效果顯著，均可用于分子標(biāo)記輔助選擇。TG161的標(biāo)記輔助選擇優(yōu)于TG237。 (4)從BC1群體的80個單株中篩選出了8個發(fā)生分子標(biāo)記單交換的單株，其中4個單株：260-68、260-64、260-16和260-57的可溶性固形物含量分別為：5。97、5。92、5。84、5。84，遠高

6、于各個組合的平均水平?？梢钥隙?，這4個單株含有的來自多毛番茄的外源片段比TA1218要短，不良基因連鎖累贅的影響進一步消弱，更進一步突出目的基因的作用。而且除了可溶性固形物含量較高外，4個單株均表現(xiàn)為粉紅色果色，生長勢、果實大小、單果重、總生物量等綜合農(nóng)藝性狀較好，可作為優(yōu)異的番茄高可溶性固形物育種種質(zhì)。 (5)使用cDNA-AFLP技術(shù)對番茄果實不同發(fā)育階段的的基因差異性表達進行分析，獲得了95個在嫩葉及果實的膨大期、綠熟期、

7、轉(zhuǎn)色期和完全成熟期特異表達的TDF。在NCBI中的nr庫里進行BLAST分析發(fā)現(xiàn)9個TDF與已發(fā)表的基因、mRNA或cDNA克隆的序列有較高的相似性。其中一個TDF-23-262R-245來自262(LA1563×9706)的紅熟期，由引物組合E11/M48經(jīng)選擇性擴增后獲得，長度為245bp，該TDF與擬南芥(Arabidopsisthaliana)中編碼ATPbinding/ATP-dependenthelicase/helicas

8、e/nucleicacidbindingATlG63250mRNA的序列具有較高的相似性。表明該基因在紅熟期特異表達。有可能涉及果實從轉(zhuǎn)色到紅熟發(fā)育期中物質(zhì)的合成和積累的代謝調(diào)節(jié)作用，從而造成該品質(zhì)番茄果實的可溶性固形物表現(xiàn)獨有。TDF-15-269L-296序列與TomatorbcS3Ageneforribulose1,5-bisphosphatecarboxylae/oxygenasesmallsubunit基因具有較高的相似性，該

9、TDF的272個堿基序列與之具有98﹪的相似性(272/276)。該基因在光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化代謝中起調(diào)節(jié)作用，具有催化氧化戊糖，合成三磷酸腺苷的功能。 (6)14個TDF與己知功能的基因序列的同源性相比較低，在EST庫中找到相似性很高的己知EST。從中選取長度合適，關(guān)鍵時期差異表達的TDF，利用網(wǎng)絡(luò)信息資源對其進行電子克隆，氨基酸結(jié)構(gòu)以及功能預(yù)測分析等。最終獲得一條1167bp包含完整ORF的DNA鏈，其編碼一條長度為163的肽鏈。對

10、這條氨基酸序列的預(yù)測分析可知其分子量為17。96KD，等電點為7。76，有5個磷酸化位點的跨膜蛋白，并推測出相應(yīng)的二級和三級結(jié)構(gòu)，對其的功能預(yù)測分析結(jié)果表明該氨基酸序列的功能與乙醇脫氫酶相關(guān)。 (7)另外有3個TDF，無論在基因庫還是在EST庫中，都沒有搜索到較高相似性的已知基因或EST序列，表明其在已有的數(shù)據(jù)庫中沒有相似的序列，為首次獲得的cDNA片段，其所在的基因有可能是未有報道過的新基因。對其深入研究獲得該cDNA全長以及