新型非融合可溶性原核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，市場(chǎng)上近30％的重組蛋白藥物是用大腸桿菌生產(chǎn)的。然而，由于大腸桿菌不具備真核生物的部分翻譯后修飾、蛋白折疊的部分調(diào)控分子等原因，很多真核蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，往往不能正確折疊而形成不可溶的包涵體，此外，還存在表達(dá)量低、表達(dá)外源蛋白無(wú)活性等問(wèn)題。對(duì)于重組蛋白的高效生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，不僅要獲得高產(chǎn)的重組蛋白，更重要的是得到高生物活性的分子。目前廣泛使用的策略有目的蛋白與分子伴侶等的共表達(dá)、與具有助溶作用的蛋白或蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)等。但是，融合

2、表達(dá)可能影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)和活性、共表達(dá)通常需要多個(gè)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化等，各自存在一些缺點(diǎn)，因此，開(kāi)發(fā)建立新的外源蛋白在大腸桿菌中的非融合的高效表達(dá)系統(tǒng)，具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　在早期研究中，我們發(fā)現(xiàn)利用原核系統(tǒng)特有的翻譯偶聯(lián)現(xiàn)象，使用硫氧還蛋白Trx等構(gòu)建了一系列高效非融合、可溶的表達(dá)載體系統(tǒng)pTIG-Trx/MBP/GST等，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞因子、細(xì)菌毒素、單鏈抗體等七十多種蛋白及其突變體在大腸桿菌中的高效、可溶表達(dá)，表明利用

3、翻譯偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)目的蛋白高效、非融合可溶性表達(dá)是一種現(xiàn)實(shí)、可行的策略。
　　2011年，Todd H.Tider等通過(guò)對(duì)宿主抗病毒先天免疫機(jī)制等的研究，設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種廣譜抗病毒蛋白R(shí)Nase L-Apaf(RA)，呈現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，但其在原核系統(tǒng)中表達(dá)困難，一定程度上限制了其潛在的臨床應(yīng)用。
　　為了提高廣譜抗病毒蛋白R(shí)A在大腸桿菌中的表達(dá)量，提高蛋白藥物的臨床應(yīng)用潛能，本課題利用翻譯偶聯(lián)現(xiàn)象，通過(guò)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控元

4、件序列以及短的高效表達(dá)前導(dǎo)肽序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種新型非融合高效原核表達(dá)系統(tǒng)pTIG-LP，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白R(shí)A在大腸桿菌中表達(dá)量的增加，總量約為單獨(dú)表達(dá)的27倍。目的蛋白只有約10％為可溶，嚴(yán)重影響了活性RA的產(chǎn)量，并在后期進(jìn)行了分析。
　　為了進(jìn)一步提高RA在大腸桿菌中的可溶性，本課題利用具有廣泛助溶活性的SUMO蛋白為輔助蛋白，利用翻譯偶聯(lián)現(xiàn)象，以pET系列載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建一種新型非融合可溶原核表達(dá)系統(tǒng)pTIG-mSUMO/RA

5、，有效實(shí)現(xiàn)了RA在大腸桿菌中表達(dá)量和可溶性的同時(shí)增加，其蛋白表達(dá)總量約為單獨(dú)表達(dá)的2倍，可溶蛋白比例提高到50％，大大提升了其臨床應(yīng)用潛能。
　　總之，本課題通過(guò)利用翻譯偶聯(lián)現(xiàn)象，構(gòu)建了非融合高效原核表達(dá)系統(tǒng)pTIG-LP和pTIG-mSUMO等，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白R(shí)A表達(dá)量的提高、可溶性的增加，再一次證實(shí)利用翻譯偶聯(lián)促進(jìn)外源真核蛋白在原核系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，提出了提高偶聯(lián)載體穩(wěn)定性的優(yōu)化方案。為實(shí)現(xiàn)蛋白藥物在原核系