小牛凝乳酶基因在大腸桿菌中可溶性表達(dá)研究.pdf

1、凝乳酶（Chymosin,CYM）是干酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，傳統(tǒng)的凝乳酶來源是沒有斷奶的小牛皺胃，但是隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，每年宰殺上千萬頭犢牛以獲得凝乳酶的方法顯然是與現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展極不協(xié)調(diào)的。為解決這一突出矛盾，80年代以來，美、日、英、蘇等國(guó)相繼開展了凝乳酶基因工程研究。由于重組凝乳酶在理化性質(zhì)和生物學(xué)活性接近于天然蛋白質(zhì)，且可以通過大規(guī)模制備源源不斷地獲得，目前已被廣泛的應(yīng)用于干酪的生產(chǎn)。
　　在研究和生產(chǎn)中，大多數(shù)情況

2、下我們都希望能夠獲得大量的可溶性重組蛋白。但是，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)通常會(huì)產(chǎn)生不溶的無活性的蛋白聚集，即包涵體（Inclusion Bodies,IB），這是該系統(tǒng)應(yīng)用的巨大障礙。隨著對(duì)大腸桿菌中蛋白質(zhì)折疊機(jī)制的深入研究，目前己經(jīng)找到了一些提高重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的方法：其中，低溫誘導(dǎo)和融合表達(dá)策略是最有效的方法。
　　本文以含有小牛凝乳酶cDNA的pUC18-CYM質(zhì)粒為模板，通過rKOD DNA聚合酶反應(yīng)體系對(duì)CYM基因

3、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游增加了Hind III酶切位點(diǎn)、下游增加了Xba I酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pUC57克隆載體，利用兩種不同的可提高可溶性表達(dá)的載體，即冷啟動(dòng)表達(dá)載體（pCold）和低溫融合表達(dá)載體（pCold-SUMO）構(gòu)建pCold-CYM與pCold-SUMO-CYM原核表達(dá)系統(tǒng)，并選擇先進(jìn)的突變體菌株（Arctic和 Origami）作為宿主菌對(duì)CYM基因進(jìn)行原核表達(dá)。同時(shí)，研究了表達(dá)溫度、融合標(biāo)簽、誘導(dǎo)條件等因素對(duì)蛋白表達(dá)

4、量和表達(dá)形式的影響?？扇苄苑治鼋Y(jié)果表明，通過低溫誘導(dǎo)可明顯地放慢細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)速率，減少二硫鍵錯(cuò)誤折疊幾率；融合標(biāo)簽的選擇可極大地影響蛋白的表達(dá)量和可溶率，并可以在此基礎(chǔ)上通過表達(dá)條件的優(yōu)化使蛋白取得良好的可溶效果。此外，正確選擇突變體菌株也可以有效地幫助蛋白減少二硫鍵的錯(cuò)配幾率，促進(jìn)其正確折疊從而增加蛋白可溶性。我們通過研究牛凝乳酶蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)方案，對(duì)各種影響可溶性幾率的條件進(jìn)行了分析和優(yōu)化，并根據(jù)本研究結(jié)果初步建立了