大鼠TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5相互作用研究.pdf

1、第一部分大鼠TRPV4全長及氨基端、羧基端胞質內(nèi)片段和膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5全長表達載體的構建及表達
　　 背景：
　　 瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4（transient receptor potential vanilloid receptor4，TPRV4）是一種非選擇性通透性陽離子通道，具有機械敏感性，其廣泛分布于動物腦、背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）、腎和肺等組織。TR

2、PV4可被多種刺激激活，開放時引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的明顯升高。TRPV4參與生物體傷害性感受的傳導，在DRG神經(jīng)元介導的疼痛傳遞過程中起重要作用。大鼠TRPV4全長為871個氨基酸(aminoacid，aa)，與其他TRP家族成員相似，TRPV4通道結構包括氨基端(Ntermini，Nt)、羧基端(Ctermini，Ct)兩個胞質內(nèi)片段及6個跨膜區(qū)(TM1-TM6)，并在TM5和TM6之間形成一個袢環(huán)結構。目前認為，TRPV4的胞質內(nèi)

3、片段是TRPV4與其他蛋白相互作用的結構域。
　　 我們的前期研究提示，TRPV4與DRG損傷后的機械痛敏有關，但持續(xù)受壓后DRG上TRPV4通道表達升高的機制尚待研究。對持續(xù)受壓28天的大鼠DRG進行蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)與細胞骨架有關的膜聯(lián)蛋白A2的表達明顯增高，而細胞骨架微管蛋白β5明顯降低。因此推測細胞骨架（微管蛋白β5）及其相關蛋白（膜聯(lián)蛋白A2）可能通過某種途徑參與了機械性疼痛傳導過程中TRPV4通道表達的調控。

4、>　　 膜聯(lián)蛋白(annexins)家族是一類Ca2+依賴性膜磷脂結合蛋白。膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2)是膜聯(lián)蛋白家族成員，與內(nèi)質網(wǎng)膜動力學、囊泡運輸?shù)扔嘘P。S100A10-膜聯(lián)蛋白A2復合體可與TRPV5及TRPV6通道結合，調節(jié)通道活性。微管蛋白β5（tubulinβ5）是微管蛋白的一個亞型。α/β微管蛋白異二聚體是微管的主要組成部分，微管作為重要的細胞骨架成分在許多關鍵性細胞活動中發(fā)揮重要作用。微管與神經(jīng)元結構與功能有關，

5、微管動力學的改變可以導致神經(jīng)的病理學改變。微管蛋白二聚體及聚合的微管可以Ca2+依賴性的結合于TRPV1，調節(jié)通道功能。目前有研究表明細胞骨架及其相關蛋白，如膜聯(lián)蛋白A2和微管蛋白β與細胞機械刺激傳導過程關系密切，但其分子機制尚不明確。
　　 很多既往研究提示TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5存在相互作用。本實驗旨在通過基因工程技術構建重組真核表達載體，為下一步研究各蛋白的功能及相互作用提供必要的載體模型。
　　 目

6、的：通過基因工程學技術，克隆TRPV4及其N、C末端基因，構建標簽表達載體。用TRPV4各段及膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5標簽質粒轉染細胞，行westernblot及細胞免疫熒光技術檢測其蛋白表達及細胞內(nèi)分布情況。
　　 方法：以美國Duke大學W.Liedtke教授贈與的TRPV4cDNA全長質粒為模板，設計特異性引物，采用PCR、酶切、連接、轉化、搖菌、質粒提取等步驟，構建TRPV4及其Nt、Ct帶Myc標簽表達載體。以本課題

7、組制備的膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5的FLAG標簽質粒為模板，通過轉化、搖菌擴增、質粒提取等步驟獲得大量質粒備用。
　　 TRPV4全長及胞質內(nèi)片段、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5重組質粒轉染HEK293細胞后，采用westernblot和細胞免疫熒光檢測外源基因在轉染細胞內(nèi)的表達。
　　 結果：
　　 1.TRPV4cDNA全長及氨基端、羧基端標簽表達載體的成功構建
　　 PCR成功擴增TRPV4cDNA全長

8、及胞質內(nèi)氨基端、羧基端基因片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在相應位置出現(xiàn)DNA條帶。重組質粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定。測序結果與Genebank基因序列完全一致，插入方向和讀碼框架正確，重組質粒構建正確。
　　 2.TRPV4全長及各段載體、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在轉染細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達
　　 TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5蛋白表達載體轉染細胞蛋白樣品，分別在相應98kD、39kD、55kD處出現(xiàn)單一蛋白條帶，pc

9、DNA3.1(+)空載體與pcDNA3.1-Myc，HisA空載體對照組和陰性對照組無特異條帶出現(xiàn)。
　　 重組質粒分別轉染HEK293細胞48小時后，細胞免疫熒光檢測到外源基因在HEK293細胞中有表達。結果提示，TRPV4主要位于細胞膜，胞質內(nèi)也有少量分布，膜聯(lián)蛋白A2在細胞膜和胞質內(nèi)都有分布，微管蛋白β5也廣泛分布于胞膜和胞質。轉染pcDNA3.1(+)空載體組和陰性對照組的HEK293細胞內(nèi)未檢測到標記的蛋白熒光信號。<

10、br>　　 結論：
　　 本部分實驗成功構建了TRPV4全長及氨基端、羧基端胞質內(nèi)片段和膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5表達載體，并通過轉染使其在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。為后續(xù)在體外相對單純的環(huán)境下觀察TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在傷害性刺激傳導的作用，及各蛋白間的相互作用研究打下基礎，提供必要的載體模型。
　　 第二部分大鼠TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5相互作用
　　 研究背景：DRG是痛覺傳入的第一級神

11、經(jīng)元，在神經(jīng)病理性疼痛的外周機制中起著重要作用。DRG神經(jīng)元作為感覺細胞，參與外周傷害性刺激傳導，其上聚集了許多傳感器受體及離子通道。研究發(fā)現(xiàn)TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2和微管蛋白p5在CCD模型大鼠DRG中的蛋白表達發(fā)生了變化。TRPV4通道屬于TRP通道家族成員，是一種Ca2+通透性機械敏感性離子通道，表達于多種機械感受器細胞，可被多種刺激激活。所有的TRP通道都含6個跨膜區(qū)和氨基端及羧基端兩個胞質內(nèi)片段。
　　 胞質內(nèi)末端結構

12、域含錨蛋白重復序列、PDZ-結合區(qū)及卷曲螺旋結構域，被認為是調節(jié)通道功能的關鍵結構區(qū)。許多研究提示TRP通道可通過直接相連，或中間的支架蛋白與細胞骨架的聯(lián)系。Α肌動蛋白將TRPP3錨定在肌動蛋白細胞骨架，并增強通道功能。另一個Ca2+高通透性TRP通道，TRPM7與肌動球蛋白(微絲)細胞骨架相連。微管蛋白β是一種TRPV1特異性相互作用蛋白。微管蛋白二聚體及聚合的微管可以與TRPV1結合，且這一結合是Ca2+敏感性的。小鼠MAP7是一種

13、TRPV-Ct結合蛋白，其可增強TRPV4在膜上的表達并可能與細胞骨架的微絲相連。TRPV4與微管及肌動蛋白細胞骨架存在直接相互作用，且主要作用于C末端。所有以上研究支持TRPV4與細胞骨架存在相互作用的觀點。
　　 膜聯(lián)蛋白A2是第一個發(fā)現(xiàn)與肌動蛋白細胞骨架相連的膜聯(lián)蛋白家族成員，其呈Ca2+依賴性與肌動蛋白絲結合。S100A10-膜聯(lián)蛋白A2復合體作為TRPV家族新成員，TRPV5及TRPV6的輔助蛋白，其與這些通道的結合對

14、通道活性的調節(jié)起關鍵作用。膜聯(lián)蛋白的功能是Ca2+依賴性的，而TRPV4是對Ca2+高通透性的，它們的功能都與Ca2+緊密聯(lián)系。微管蛋白β5屬于細胞骨架蛋白。肌動蛋白細胞骨架、微管蛋白和許多離子通道都通過整合蛋白和黏著斑與細胞外基質相連，形成細胞的機械性結構。機械力可通過細胞骨架傳導至機械敏感性部位，因此肌動蛋白和微管參與了細胞對機械性刺激的反應過程。細胞骨架的調節(jié)在神經(jīng)元的功能中起重要作用。細胞骨架傳導機械力，TRPV4通道感受機械刺

15、激，因此推測細胞骨架與TRPV4之間存在相互作用。TRPV4可以調節(jié)微管和肌動蛋白，而微管動力學也可以影響TRPV4的活性。微管蛋白、肌動蛋白和傷害性信號元件在TRPV4-Ct構成了一個超分子信號復合體。研究提示，細胞骨架調節(jié)TRPV4通道的機械感受性，且它們的相互作用在神經(jīng)性病理疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮作用?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們推測TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5之間存在相互作用，且這一作用參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。
　　 本部

16、分實驗旨在在DRG組織及離體過表達細胞中檢測TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5之間的相互作用，從而為研究DRG受損后TRPV4介導的機械性痛敏的發(fā)生機制提供新的基礎，為臨床治療腰背痛等慢性神經(jīng)病理性疼痛提供新的思路。
　　 目的：檢測DRG組織及離體轉染細胞中，TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5是否存在相互作用。
　　 方法：
　　 1．組織免疫共沉淀
　　 提取健康成年雄性大鼠腰椎DRG組織蛋白

17、，用TRPV4抗體行免疫共沉淀。沉淀后的復合物用TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β的抗體進行檢測，觀察是否存在目的蛋白。
　　 2．Western blot檢測共轉染細胞蛋白的共表達
　　 重組質粒TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白B5質粒分別以等摩爾比共轉染HEK293細胞，提取蛋白后行westen blot，檢測共轉染蛋白樣品中各蛋白表達情況。
　　 3．共轉染細胞中TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2的相互作用及共定

18、位檢測
　　 質粒pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His與pcDNA3.1(+)-Anxa2-FLAG等摩爾比轉染HEK293細胞48小時后，提取細胞蛋白，分別用anti-Myc及anti-FLAG抗體進行免疫共沉淀。沉淀后的復合物行western blot分析，分別用anti-Myc(檢測TRPV4)及anti-FLAG(檢測膜聯(lián)蛋白A2)抗體檢測目的蛋白是否存在。
　　 爬片細胞共轉染48小時后，沖洗固定后行細

19、胞免疫熒光檢測，觀察兩種信號蛋白的共分布情況，并計算共分布系數(shù)。
　　 4．共轉染細胞中TRPV4與微管蛋白p5的相互作用及共定位檢測
　　 質粒pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His與pcDNA3.1(+)-Tubb5-FLAG等摩爾比轉染。HEK293細胞48小時后，提取細胞蛋白，分別用anti-Myc及anti-FLAG抗體進行免疫共沉淀。沉淀后的復合物行western blot分析，分別用anti-Myc(

20、檢測TRPV4)及anti-FLAG(檢測微管蛋白p5)抗體檢測目的蛋白是否存在。
　　 爬片細胞共轉染48小時后，行細胞免疫熒光檢測，觀察兩種信號蛋白的共分布情況，并計算共分布系數(shù)。
　　 結果：
　　 1．組織免疫共沉淀
　　 經(jīng)TRPV4抗體沉淀的免疫復合物行western blot分析，可檢測到TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白p蛋白，即膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白p5均可被TRPV4抗體沉淀。

21、　　 2．Western blot法分別檢測共轉染HEK293細胞蛋白樣品的共表達情況。pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His/pcDNA3.1(+)-Anxa2-FLAG表達載體組在相對分子量為98kD及39kD處分別出現(xiàn)單一蛋白條帶，pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His/pcDNA3.1(+)-Tubb5-FLAG表達載體組在相對分子質量為98kD及55kD處分別出現(xiàn)單一蛋白條帶。
　　 3．TRPV4與膜聯(lián)

22、蛋白A2的相互作用
　　 在共轉染細胞蛋白樣品中，TRPV4及膜聯(lián)蛋白A2不能相互沉淀。對兩種質粒共轉染細胞的免疫熒光檢測可觀察到兩種外源性蛋白的共分布，共分布區(qū)域顯示為黃色。經(jīng)計算，兩種蛋白的Mander's共分布系數(shù)為0.58+0.113。
　　 4．TRPV4與微管蛋白β5的相互作用
　　 在共轉染細胞蛋白樣品中，TRPV4及微管蛋白B5可以相互沉淀。對兩種質粒共轉染細胞的免疫熒光檢測可觀察到兩種外源性蛋白

23、的共分布，共分布區(qū)域顯示為黃色。經(jīng)計算，兩種蛋白的Mander's共分布系數(shù)為0.67+0.072。在TRPV4Nt與微管蛋白p5共轉染的細胞蛋白樣品中，未檢測到兩者的免疫共沉淀。
　　 結論：
　　 TRPV4與微管蛋白β5、膜聯(lián)蛋白A2間存在相互作用。研究結果提示，TRPV4與微管蛋白β5相連，作為一個復合體發(fā)揮作用，但TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2不是直接相連，可能是通過某些中問媒介相連，或僅僅在某些生理條件下相連。TR