癌蛋白TRE17與MLC2相互作用的初步鑒定.pdf

1、目的： 與動(dòng)物比較,人類腫瘤的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜。深入研究功能尚不清楚的腫瘤相關(guān)基因包括癌基因?qū)⒂兄谕耆U明人類腫瘤的發(fā)生機(jī)制。TRE17是一個(gè)功能尚不清楚的癌基因,其導(dǎo)致正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制有待闡明。初步明確TRE17與肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈(myosinregulatory light chain,MLC2)之間的相互作用將有助于深入研究TRE17在細(xì)胞骨架重塑和腫瘤發(fā)生中的作用,為腫瘤的診斷、預(yù)防和治療提供初步線索。

2、 方法： 為研究TRE17癌蛋白與MLC2蛋白之間的相互作用,用RT-PCR方法,從制備的HeLa細(xì)胞總RNh中擴(kuò)增了MLC2蛋白的cDNA完整開放讀碼框架(open reading frame,ORF),并插入pGEX-6P-1載體,構(gòu)建了GST-MLC2融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒MLC2/pGEK;在將pGEX-6P-1和MLC2/pGEX質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌BL21,并經(jīng)IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)GST和GST-MLC2蛋白后,在非

3、變性條件下(超聲破碎儀裂解細(xì)菌菌體)用Glutathione Sepharose 4B對(duì)GST和GST-MLC2蛋白分別進(jìn)行了親和純化。用HA-TRE17(447)蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒HA-TRE17(447)/pcDNA3轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞,以GST蛋白為對(duì)照,將純化的GST-MLC2蛋白與該轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物進(jìn)行GST pull-down分析；沉淀的蛋白進(jìn)行SOS-PAGE后,用抗HA抗體進(jìn)行WesternBlot分析,以檢測(cè)沉淀中的H

4、A-TRE17(447)蛋白。 以pGEX-6P-1為載體,分別構(gòu)建了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco/pGEX;轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌BL21后,用IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)和在非變性條件下純化了GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白；在用PreScissionTM蛋白酶切除GST-MLC2蛋白中的GST標(biāo)

5、志蛋白后,以GST蛋白為對(duì)照,將獲得的不含GST標(biāo)志蛋白的MLC2蛋白分別與GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco融合蛋白進(jìn)行GST pull-down分析；沉淀的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后,用考馬斯亮藍(lán)染色觀察沉淀中的MLC2蛋白,以探討TRE17癌蛋白是否直接結(jié)合MLC2蛋白。 結(jié)果： 構(gòu)建的GST-MLC2融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒MLC2/pGEx經(jīng)BamH和EcoR I雙酶切后出現(xiàn)525 bp特征性

6、片段,MLC2 cDNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)無誤。大腸桿菌BL21在分別用MLC2/pGEX和pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化后,由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子量均符合預(yù)期,為46.6 kDa(GST-MLC2融合蛋白)和28.4 kDa(GST蛋白),而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的陰性對(duì)照,則未見相應(yīng)部位出現(xiàn)蛋白條帶。誘導(dǎo)表達(dá)GST-MLC2和GST蛋白的細(xì)菌菌體被用超聲破碎儀裂解,并經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和純化后,GST-MLC2

7、和GST蛋白純度已達(dá)90％以上。以GST蛋白為對(duì)照,用GST-MLC2融合蛋白與經(jīng)HA-TRE17(447)蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒HA-TRE17(447)/pcDNA3轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞裂解物進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)后,用抗HA抗體進(jìn)行Western Blot分析,顯示MLC2蛋白與TRE17(447)結(jié)合,而陰性對(duì)照GST蛋白并不結(jié)合TRE17(447),證實(shí)MLC2蛋白特異性結(jié)合TRE17(447)。 經(jīng)BamH I和

8、Xho I雙酶切后,GST-TRE17(447)/pGEX質(zhì)粒出現(xiàn)1360 bp特征性片段,而GST-TRE17onco/pGEX質(zhì)粒出現(xiàn)2415 bp特征性片段。TRE17(447)和TRE17onco cDNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)無誤。大腸桿菌BL21分別用GST-TRE17(447)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒GST-TRE17(447)/pGEX和GST-TRE17onco融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒GST-TRE17onco/pGEX轉(zhuǎn)化后,由IPTG誘導(dǎo)

9、表達(dá)的蛋白分子量均符合預(yù)期,大約為78.3 kDa(GST-TRE17(447)蛋白)和116.4 kDa(GST-TRE17onco蛋白)。而未用IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照,則未見相應(yīng)部位出現(xiàn)蛋白條帶。在非交性條件下,GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白被用Glutathione Sepharose4B進(jìn)行了初步親和純化。以GST蛋白為對(duì)照,用純化的GST-TRE17(447)和GST-TRE17onco蛋白分別與不含