死亡受體6相互作用蛋白質(zhì)的篩選與鑒定.pdf

1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文死亡受體6相互作用蛋白質(zhì)的篩選與鑒定姓名：王梁華申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：焦炳華倪健20040401i桀華博士學位論文fce受體6相互作用蛋白噴的篩選與簽定的相互作用已有驗證，由此證實了細菌雙雜交可以用于細胞外蛋白質(zhì)相互作用的研究。同時證實了OCIF／OPG與TRAIL能直接結合，但親和力較TRAIL與DR4、TRAIL與DR5要低。二、細菌雙雜交系統(tǒng)篩選與DR6相互作用的分子以pBT

2、構建編碼DR6細胞外區(qū)域(43234aa)與Fc片段融合表達的質(zhì)粒，與Stratagene公司購買的細菌雙雜交用人肝細胞cDNA文庫(以pTRG構建)共轉(zhuǎn)化XLlBlueMRF，錨于250gg／ml羧芐青霉素的LB—CTCK平皿。24h后長出大量菌落(300個／平皿)，隨機挑選10個克隆進行測序結果顯示篩選到的主要是與Fc片段結合的蛋白編碼序列。提高羧芐青霉素濃度至500“∥ml陽性克隆略有減少(約100個／平皿)。將DR6細胞外區(qū)域編

3、碼序列直接插入pBT，按上述方法在500gg／ml羧芐青霉素的LBCTCK平皿上篩選了8輪次，共計360余塊15cm平皿，每次的轉(zhuǎn)化效率在2107～6107間。結果共得到1200余個陽性克隆，用XGalPETG平皿進一步驗證，得到了約300個陽性克隆，全部進行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于細胞內(nèi)(如核內(nèi)、胞漿、線粒體等)的蛋白編碼序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphalantitrypsin)，4次hepsin，2次未知的同一

4、新基因，2次白蛋白，2次補體1T亞單位，2次轉(zhuǎn)鐵蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受體、AII脂蛋白、C脂蛋白、C反應蛋白、視黃酸受體q、血清類粘蛋白】、血清素等編碼序列各1次。調(diào)研文獻分析所報道這些蛋白的功能和研究現(xiàn)狀，選擇了II型跨膜蛋白絲氨酸蛋白酶家族分子hepsin與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族分子maspin進行進一步研究。三、重組表達hepsin與maspin，胺化磁珠法分析與DR6的結合設計相應的引物，以肝細

5、胞cDNA文庫為模板，PCR擴增了其中的hepsin細胞外區(qū)域和maspin成熟肽的編碼序列，插入pMALTMProteinFusionandPurificationSystem(NewEnglandBiolabs公司)中的pMAL—c2載體，進行與麥芽糖結合蛋白(MBP)融合的原核重組表達。表達產(chǎn)物用試劑盒所帶的直鏈淀粉親和層封亍柱初步純化，達到電泳純。DR6細胞外區(qū)域同樣表達并純化。將hepsin、maspin及MBP蛋白分別共價結