逐級急性肝損傷大鼠血清TNF-α、IL-6和肝組織HSP70表達變化及其意義.pdf

1、目的:研究急性肝損傷大鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6和肝組織內HSP70的表達變化,從而為臨床探索早期診斷治療急性肝損傷提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 方法:10周齡健康雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)一周,隨機分為4組(每組10只):A組,假手術組(Group A,n=10)；B組,50％肝切除組(Group B,n=10)；C組,70％肝切除組(Group C,n=10)；D組90％肝切除組(Group D,n=10)。所有大鼠術

2、前禁食12h禁水4h。氯胺酮注射液按150mg／kg劑量大鼠腹腔注射麻醉。麻醉成功后,無菌條件下取肋緣下橫切口入腹。按照Kubota T方法改進,采用改良無血切肝術建立模型。開腹后游離肝臟周圍組織,暴露大鼠肝臟,游離肝動脈、門靜脈和膽道。用近肝門處結扎法沿逆時針方向依次切除相應肝葉。檢查無出血后關閉腹腔。參照史冀華等文獻方法,SD大鼠50％肝切除方法為順序切除肝乳頭葉、左外葉、三角葉；70％肝切除方法為順序切除肝左外葉、左內葉、肝中葉；

3、90％肝切除方法為順序切除肝左葉、肝中葉、肝右后葉、三角葉；對照組即假手術組,開腹后游離肝周韌帶,暴露肝臟約20分鐘后關腹。參考預實驗結果,于24h后稱重,在氯胺酮麻醉下采血,取標本,心臟采血應用全自動生化儀測定各組大鼠肝功能指標。雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-6、TNF-a。迅速取出完整肝臟稱重,計算肝指數(shù)即:肝濕質量／大鼠體質量×100％。并在各組大鼠肝臟相同部位切取肝組織1塊,置于10％甲醛溶液中固定,制

4、備石蠟切片。石蠟切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色后顯微鏡下觀察肝組織病理改變；免疫組化檢測各組肝組織HSP70表達情況,應用Image plus5.0進行圖像分析,計算積分光密度值；積分光密度值表示HSP70蛋白表達量。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±S)表示,采用單因素方差分析,方差不齊者應用H檢驗,比較各組實驗數(shù)據(jù)的差別；相關性分析應用直線相關分析,認為P<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　 結果:實驗大鼠40只全部存活。(1)一

5、般情況,各組大鼠術后1天生存率100％。對照組動物精神飽滿,靈活好動,進食飲水無明顯異常,皮毛光澤度良好；模型組各組大鼠術后各項肝功能指標明顯升高,出現(xiàn)不同程度的精神萎靡不振、活動減少、尿色發(fā)黃、鼠毛豎立、拒食等狀態(tài)。90％肝切除模型組術后出現(xiàn)肝功能衰竭的征象,表現(xiàn)為術后蘇醒時間延長、嗜睡、對刺激反應弱、眼睛出現(xiàn)血性分泌物、鼠毛脫落、腹壁手術切口滲血、皮膚發(fā)黃、尿少色深黃等。(2)HE染色顯示,A組肝臟組織無明顯異常變化；肝切除各組大鼠

6、肝組織顯示廣泛肝細胞空泡樣變性,細胞腫脹,細胞的泡漿、胞核內出現(xiàn)大小不一的空泡。肝竇明顯擴張,散在肝細胞點狀壞死,匯管區(qū)界限清楚,少量炎性細胞浸潤,肝小葉形態(tài)完整。D組可見肝細胞胞漿內小空泡相互融合成大空泡,細胞核懸于中央,胞漿空白,細胞形體顯著腫大。(3)免疫組化數(shù)據(jù)采用積分光密度值(IOD)作半定量分析,陽性細胞胞漿或胞核內出現(xiàn)棕黃色顆粒。各模型組與對照組相比較陽性細胞數(shù)明顯增多,HSP70含量明顯升高(P<0.01)。(4)ELI

7、SA法檢測大鼠血清細胞因子IL-6、TNF-α顯示造模24h后各模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平較對照組明顯增高(p<0.01),模型組各組組間比較也有顯著差異(p<0.01,p<0.05)。
　　 結論:(1)成功建立大鼠逐級急性肝損傷模型,此模型主要表現(xiàn)為各項肝功能指標明顯升高,出現(xiàn)不同程度的肝功能損害,肝臟空泡樣變性明顯,甚至發(fā)生點狀壞死。(2)急性肝損傷大鼠,血清TNF-α、IL-6水平明顯增高且INF-α、IL-