整合素αvβ6調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移和侵襲性生長的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)腸癌為目前常見的影響人類健康的惡性腫瘤之一.癌細(xì)胞侵襲浸潤性生長和遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是影響結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)鍵因素，如何抑制癌腫侵襲浸潤性生長以及如何控制結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移是目前癌癥研究中最具有挑戰(zhàn)性的關(guān)鍵課題。大量研究資料證明，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程與細(xì)胞表面的生物學(xué)特性密切相關(guān)，是受細(xì)胞粘附分子和基質(zhì)降解酶調(diào)控的，但是這些蛋白分子是如何在結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，如何調(diào)控結(jié)腸癌侵襲性生長，我們卻知之

2、甚少。 在癌細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子家族中，整合素家族是最具有特征性的，特別是整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞的表達(dá)模式與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。整合素αvβ6在健康成人上皮細(xì)胞不表達(dá)或極少表達(dá)，但是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中卻誘導(dǎo)高表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道：在口腔白斑病整合素αvβ6誘導(dǎo)表達(dá)而且是惡性變?yōu)轺[狀細(xì)胞癌的必須的前提條件；在口腔鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌也觀察到整合素αvβ6的新生表達(dá)。前期研究證明：無論在體內(nèi)還是在體外，整合素αvβ6促進(jìn)了結(jié)腸

3、癌細(xì)胞的增殖和生長.此外，αvβ6可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的分泌，通過提高對(duì)細(xì)胞周圍基質(zhì)的降解，增強(qiáng)癌細(xì)胞的浸潤遷徙能力。不難想象，癌細(xì)胞能克服和逃避正常細(xì)胞擁擠和密度積壓障礙，而無限制的侵襲性生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可能是通過癌細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)αvβ6而介導(dǎo)MMP-9分泌實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是探討αvβ6在調(diào)控結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移和侵襲性生長方面的作用機(jī)制，為進(jìn)行有關(guān)結(jié)腸癌的進(jìn)一步研究提供全新的思路和理論基礎(chǔ)，有理由相信特異性針對(duì)

4、整合素αvβ6的靶向治療策略，對(duì)進(jìn)展期結(jié)腸癌病人的治療將起到重要的作用。 第一部分:整合素αvβ6調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移和肝臟定植潛能的實(shí)驗(yàn)研究目的結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌特征性的惡性行為之一，整合素αvβ6與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而，整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞表面的表達(dá)程度與結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系我們知之甚少。 目的： 是探討整合素αvβ6與結(jié)腸癌細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移和肝臟定植潛能的關(guān)系。 材料與方法

5、 1.免疫組織化學(xué)染色是本實(shí)驗(yàn)檢測整合素αvβ6在結(jié)腸癌組織和肝臟轉(zhuǎn)移癌組織表達(dá)水平的重要方法，為了驗(yàn)證免疫組化結(jié)果的特異性，首先選擇不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系(WiDr細(xì)胞、SW480 wild細(xì)胞、SW480β6轉(zhuǎn)染細(xì)胞)采用免疫沉淀分析檢測單克隆抗體2G2(美國Biogen公司)的特異性。 2.隨機(jī)選擇63例的結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移病人(1995年1月至2005年1月經(jīng)過手術(shù)治療)的肝臟轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本，用抗avp6的單克隆抗體2G2作為一

6、抗，采用Elivision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。然后從2001年1月至2002年12月經(jīng)手術(shù)治療的結(jié)腸癌病人中，隨機(jī)選取結(jié)腸癌組織標(biāo)本358例，構(gòu)建成2張200點(diǎn)的組織芯片(在陜西超英生物公司制作)，采用ABC法進(jìn)行αvβ6免疫組化染色，根據(jù)免疫組化結(jié)果(αvβ6陽性或者αvβ6陰性)，將手術(shù)后病人分為兩組，進(jìn)行3年手術(shù)后肝臟轉(zhuǎn)移隨訪。 3.為了探討在進(jìn)展期結(jié)腸癌中整合素αvβ6免疫反應(yīng)性與癌細(xì)胞在肝臟定植和肝臟轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我

7、們選用了肝臟定植實(shí)驗(yàn)(肝臟組織內(nèi)直接注射結(jié)腸癌WiDr轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和肝臟轉(zhuǎn)移成瘤實(shí)驗(yàn)(經(jīng)脾臟注射結(jié)腸癌HT29轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。 4.為了探討整合素αvβ6調(diào)節(jié)結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的機(jī)制，分別用明膠酶譜法和Biotrak MMP-9活性分析系統(tǒng)檢測人工培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞(WiDr和HT29轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的分泌水平：同時(shí)采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測不同結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29和WiDr轉(zhuǎn)染細(xì)胞)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

8、 結(jié)論： 1.抗αvβ6單克隆抗體2G2特異性的識(shí)別結(jié)腸癌細(xì)胞表面的整合素αvβ6受體。 2.結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移組織比結(jié)腸癌組織具有較高的αvβ6陽性表達(dá)率，整合素αvβ6陽性表達(dá)的結(jié)腸癌患者比αvβ6陰性患者具有較高的肝臟轉(zhuǎn)移率。說明結(jié)腸癌細(xì)胞的αvβ6的免疫反應(yīng)性與結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 3.結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)歸取決于結(jié)腸癌細(xì)胞表面的生物學(xué)特性及肝臟宿主器官微環(huán)境。整合素αvβ6有助于結(jié)腸癌細(xì)胞在肝臟的

9、定植存活，有助于增強(qiáng)癌細(xì)胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力。 4.整合素αvβ6能促進(jìn)MMP-9分泌，加快細(xì)胞外基質(zhì)降解；整合素αvβ6能提高結(jié)腸癌細(xì)胞在纖維連接蛋白基質(zhì)上的趨化遷移能力；二者構(gòu)成了結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的先決條件。 第二部分 整合素αvβ6調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲性生長機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究目的結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲性生長是區(qū)別于結(jié)腸良性腫瘤的重要特征，也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素。 目的： 研究結(jié)腸癌在細(xì)胞高密度和細(xì)胞擠壓狀態(tài)對(duì)

10、結(jié)腸癌細(xì)胞表面整合素αvβ6表達(dá)的影響效果，探討αvβ6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響，以及αvβ6對(duì)癌細(xì)胞侵襲性生長的影響，進(jìn)一步揭示結(jié)腸癌細(xì)胞永生化侵襲性生長的分子機(jī)制。 材料與方法 1.用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系WiDr和SW480細(xì)胞株以及正常人角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株，分別在高、低細(xì)胞密度培養(yǎng)條件下各細(xì)胞表面的αvβ6表達(dá)水平。 2.將100例結(jié)腸癌標(biāo)本的腫瘤邊緣部分(癌細(xì)胞

11、密集相對(duì)高細(xì)胞密度)及腫瘤中心部分(癌細(xì)胞稀疏相對(duì)低細(xì)胞密度)制作成200點(diǎn)的組織芯片(陜西超英生物)，用免疫組織化學(xué)染色方法檢測分析整合素αvβ6在結(jié)腸癌不同部位的分布差異和表達(dá)強(qiáng)度區(qū)別。 3.用Biotrak MMP-9分析系統(tǒng)和明膠酶譜法分別測定不同的結(jié)腸癌WiDr細(xì)胞株和SW480細(xì)胞株，以及正常人角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞株，在高、低細(xì)胞密度培養(yǎng)條件下，MMP-9的活性和分泌水平。 結(jié)論： 1.細(xì)胞高密度

12、和細(xì)胞擠壓狀態(tài)誘導(dǎo)癌細(xì)胞αvβ6表達(dá)，是結(jié)腸癌侵襲性生長的啟動(dòng)子。 2.在結(jié)腸癌細(xì)胞，整合素αvβ6的表達(dá)呈密度依賴性增加的機(jī)制，與正常人上皮細(xì)胞不同。在高細(xì)胞密度培養(yǎng)條件下，結(jié)腸癌細(xì)胞MMP-9分泌量的增加也是由整合素αvβ6調(diào)控的，特異性的封閉整合素αvβ6受體可以減少癌細(xì)胞的MMP-9分泌水平。 3.細(xì)胞高密度誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞αvβ6持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)MMP-9的分泌，加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，是構(gòu)成結(jié)腸癌細(xì)胞永生化侵襲性生