DPC4基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長和分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和儲存等方面發(fā)揮著十分重要的作用，但是上皮源性的惡性腫瘤細(xì)胞喪失了對TGF-β的反應(yīng)性而逃避TGF-β的生長抑制作用，結(jié)果導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。DPC4被認(rèn)為是一個重要的腫瘤抑制基因。DPC4是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心分子，幾乎所有生物學(xué)效應(yīng)均是DPC4

2、與不同的Smads蛋白相互作用的結(jié)果。盡管有關(guān)DPC4的研究內(nèi)容已積累了很多，但是DPC4功能的失活對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有何影響卻知之甚少。 目的：研究DPC4基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，探討DPC4在結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及機(jī)制。 方法：采用免疫組化S-P法檢測了70例標(biāo)本(包括正常結(jié)腸粘膜、腸腺瘤和腸癌組織)中DPC4的表達(dá)情況；采用RT-PCR及Western blot分析，檢測五株結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT11

3、6、HT29、LS174T、SW480及SW620)中DPC4的表達(dá)情況，篩選出沒有DPC4表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116：通過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、酶切、凝膠電泳、基因重組技術(shù)等方法構(gòu)建PcDNA3.1-DPC4重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)DPC4的DPC4<'+>-HCT116(PcDNA3.1-DPC4轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞)細(xì)胞模型；采用免疫組化S-P法和Western blot分析

4、檢測三組細(xì)胞中DPC4的表達(dá)：通過生長曲線和平板克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖的改變；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(S％)和凋亡率的改變；采用MTT比色法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的粘附能力，Millicell小室測定法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力；腹腔移植法建立裸鼠結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型；用明膠酶譜分析方法檢測MMP-2、MMP-9活性的改變。 結(jié)果：DPC4蛋白陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)及胞核。在正常結(jié)腸粘膜和結(jié)腸腺瘤中，DPC4呈強(qiáng)

5、陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞分布在粘膜全層中。在結(jié)腸癌組織中，DPC4蛋白表達(dá)下降，其分布及著色程度呈異質(zhì)性，其中高分化腺癌尚有部分表達(dá)，低分化腺癌及轉(zhuǎn)移癌表達(dá)明顯下降，有的甚至無表達(dá)，表明DPC4在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)情況與腫瘤分期、分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)；篩選出HCT116細(xì)胞株沒有DPC4表達(dá)；成功構(gòu)建了PcDNA3.1-DPC4質(zhì)粒；構(gòu)建了DPC4穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型；與HCT116細(xì)胞及PcDNA3.1-HT116細(xì)胞相比較，DPC4<'+>-H

6、CT116細(xì)胞的倍增時間明顯延長(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.01)，克隆形成率、細(xì)胞粘附率、遷移能力和侵襲能力明顯降低(P<0.01)；HCT116和PcDNA3.1-HCT116細(xì)胞組裸鼠腹腔內(nèi)布滿癌結(jié)節(jié)，在肝臟表面及切面均可見大量癌結(jié)節(jié)，而DPC4<'+>-HCT116細(xì)胞組裸鼠腹腔內(nèi)、肝臟表面及切面的的癌結(jié)節(jié)很少；MMP-2的活性在三組細(xì)胞沒有區(qū)別，但與HCT116和PcDNA3.1-HCT116兩組細(xì)胞相比較，

7、DPC4<'+>-HCT116細(xì)胞MMP-9的活性明顯下降。 結(jié)論： 1．DPC4的低表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)； 2．成功地構(gòu)建了質(zhì)粒PcDNA3.1-DPC4，得到穩(wěn)定表達(dá)DPC4蛋白的細(xì)胞模型； 3．DPC4可能抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移； 4．DPC4對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的調(diào)控可能是通過DPC4抑制細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡兩方面的作用實現(xiàn)的； 5．MMP-9可能是DPC4