Twist基因表達(dá)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29侵襲轉(zhuǎn)移能力的體內(nèi)研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，研究在上調(diào)Twist基因表達(dá)后對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，探究Twist基因和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和E-cadherin在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象中的表達(dá)及其與結(jié)腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法:使用重組質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist和陰性對(duì)照質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD轉(zhuǎn)染并經(jīng)殺稻瘟菌素(Blasticid

2、in)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系。采用脾臟原位注射法建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，實(shí)驗(yàn)共分為三組:實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染上調(diào)Twist表達(dá)質(zhì)粒組）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）、空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）。注射30天后獲取各組裸鼠肝臟和脾臟標(biāo)本，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR，Western blot和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織的Twist和EMT相關(guān)分子標(biāo)志物N-cadherin，Vimentin和E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)

3、情況，并分析各指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果:1.成功建立裸鼠異種結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，病理檢查結(jié)果符合結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)組脾臟原位腫瘤較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組大小相近，肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目多于陰性對(duì)照及空白對(duì)照組，腫瘤大小未見明顯差異。2.實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照和空白對(duì)照組相比，腫瘤組織的Twist，N-cadherin和Vimentin分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(9.9082±0.9137，2.431±0.1636，3.0310±0.2026

4、)和蛋白表達(dá)水平(0.9916±0.0508，0.9417±0.1025，0.7231±0.0218)明顯升高(P＜0.05);E-cadherin mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平顯著降低（0.4531±0.0536，0.71±0.0613），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，Twist、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均無顯著差異(P＞0.0

5、5)。3.Twist基因mRNA表達(dá)水平在肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織較脾臟原位種植瘤組織中表達(dá)升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組肝、脾臟腫瘤細(xì)胞Twist，N-cadherin和Vimentin染色陽性細(xì)胞數(shù)多于陰性對(duì)照及空白對(duì)照組(P＜0.05)，E-cadherin染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組肝、脾臟腫瘤細(xì)胞E-cadherin染色少于陰性對(duì)照及空白對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.本研究成功建立裸鼠

6、結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，其操作安全、成瘤率較高，對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)與臨床研究均具有應(yīng)用價(jià)值。
　　2.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)Twist基因質(zhì)粒的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞株，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，可增強(qiáng)間充質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin，Vimentin mRNA及蛋白的表達(dá)水平，降低上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化。
　　3.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中肝臟轉(zhuǎn)移灶腫瘤的Twist基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平