NDRG1通過(guò)整合素β3調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　肝癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居前列，我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家之一，其新發(fā)和死亡病例數(shù)約占全球一半。肝癌早期不易發(fā)現(xiàn)，就診時(shí)多處于中晚期，治療困難，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響其預(yù)后的主要因素，因此尋找肝癌生物標(biāo)志物包括腫瘤易感基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了NDRG1能夠抑制肝癌細(xì)胞株BEL7402細(xì)胞侵襲遷移能力，NDRG1發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制是本研究的重點(diǎn)。本項(xiàng)目旨

2、在尋找NDRG1調(diào)控的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)下游基因，并探索NDRG1通過(guò)Smad2/3通路調(diào)控整合素β3(ITGB3)的表達(dá)進(jìn)而影響B(tài)EL7402細(xì)胞侵襲遷移能力的分子機(jī)制，為肝癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的線索。
　　方法:
　　1、通過(guò)PCR Array實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低NDRG1基因表達(dá)后肝癌細(xì)胞株BEL7402細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中mRNA表達(dá)發(fā)生變化的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，尋找NDRG1發(fā)揮作用的可能下游基因。
　　2、應(yīng)用West

3、ern Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在BEL7402細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中敲低NDRG1基因后可能下游基因的蛋白表達(dá)變化，鎖定ITGB3基因繼續(xù)進(jìn)行深入研究。
　　3、Real-Time PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中ITGB3 mRNA表達(dá)情況，利用siRNA技術(shù)敲低BEL7402細(xì)胞中ITGB3基因的表達(dá)，并利用Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其敲低效果。
　　4、在BEL7402細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染sh-NDRG

4、1和si-ITGB3后，利用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證整合素β3對(duì)NDRG1功能發(fā)揮的影響。
　　5、Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在BEL7402細(xì)胞中敲低NDRG1后，TGF-β/Smad通路關(guān)鍵分子Smad2、Smad3及其磷酸化蛋白p-Smad2、p-Smad3的表達(dá)變化。
　　6、向轉(zhuǎn)染了sh-NDRG1的BEL7402細(xì)胞中加入TGF-β/Smad通路抑制劑SB431542，Western Blot實(shí)

5、驗(yàn)驗(yàn)證SB431542對(duì)NDRG1引起的整合素β3蛋白表達(dá)變化的影響，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SB431542對(duì)NDRG1抑制BEL7402細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　7、在BEL7402細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-Smad2、si-Smad3或通路共同調(diào)節(jié)蛋白si-Smad4，Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證siRNA對(duì)目標(biāo)基因的干擾效果，并進(jìn)一步分別共轉(zhuǎn)染sh-NDRG1及si-Smad2、

6、si-Smad3或si-Smad4，驗(yàn)證TGF-β/Smad通路關(guān)鍵蛋白分子分別對(duì)NDRG1調(diào)控整合素β3表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、PCR Array實(shí)驗(yàn)表明敲低NDRG1基因后，CTSL1、IL-1β、ITGB3、MMP10、SERPlNE1基因在BEL7402細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，MMP13、TNFSF10基因表達(dá)減少;而在SMMC7721細(xì)胞中，ETV4、ITGB3、MMP10、SERPINE1基因的表達(dá)量增加，

7、CDH6、TNFSF10基因的表達(dá)量降低。
　　2、Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NDRG1敲低72h后，BEL7402細(xì)胞及SMMC7721細(xì)胞中整合素β3蛋白表達(dá)均上調(diào)。
　　3、ITGB3 mRNA在BEL7402細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)量最高，其次是HepG2細(xì)胞，在SMMC7721細(xì)胞中表達(dá)量最低;Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明si-ITGB3能有效干擾BEL7402細(xì)胞中整合素β3

8、的表達(dá)。
　　4、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明敲低ITGB3后sh-NDRG1誘導(dǎo)的BEL7402細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)被顯著抑制，NDRG1可能通過(guò)干擾整合素β3的表達(dá)抑制BEL7402細(xì)胞的遷移和侵襲熊力。
　　5、Western Blot實(shí)驗(yàn)表明敲低NDRG1基因后，Smad2、p-Smad2及p-Smad3的表達(dá)上調(diào)。
　　6、通路抑制劑SB431542能夠阻礙sh-NDRG1介導(dǎo)的BEL7402

9、細(xì)胞中整合素β3的上調(diào)，并且能夠阻礙NDRG1對(duì)BEL7402細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控，說(shuō)明NDRG1可能通過(guò)TGF-β/Smad通路發(fā)揮抑制BEL7402細(xì)胞的遷移和侵襲能力的作用。
　　7、Real-Time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)表明si-Smad2、si-Smad3及si-Smad4均能有效干擾相應(yīng)目標(biāo)基因mRNA和蛋白的表達(dá)，且分別敲低Smad2、Smad3及Smad4均能阻礙NDRG1對(duì)整合素β3的調(diào)控作