宮頸酸性磷酸酶的檢測(cè)及其在宮頸異常細(xì)胞篩查中的應(yīng)用.pdf

1、宮頸癌是嚴(yán)重威脅現(xiàn)代女性健康的腫瘤之一,宮頸癌在女性惡性腫瘤中位列第二,僅次于乳腺癌。然而宮頸癌的病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma viruses,HPV)被證實(shí)是宮頸癌的最重要危險(xiǎn)因子,99.7％的宮頸癌都可檢測(cè)到高危HPVDNA。宮頸癌篩查目前被認(rèn)為是控制宮頸癌發(fā)病的最有效手段。如果宮頸癌能及早被發(fā)現(xiàn),它屬于極易治愈的癌癥之一。因?yàn)榻?jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r和收入水平的原因,不同國(guó)家和地區(qū)宮頸癌的篩查

2、手段有所不同。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家,多采用細(xì)胞學(xué)檢查,尤其是液基細(xì)胞學(xué)檢查和HPV病毒DNA檢測(cè)等方法,該方法靈敏度和準(zhǔn)確度較好,但檢測(cè)成本高;而在發(fā)展中國(guó)家和欠發(fā)達(dá)地區(qū),則多采用宮頸涂片結(jié)合巴氏染色或乙酸染色法(VIA)來(lái)進(jìn)行宮頸癌初步篩查,該方法檢測(cè)成本相對(duì)較低,但特異性不好,假陰性率較高。最近有人報(bào)道,異常的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶(Cervical acid phosphatase,CAP)活性增高,但CAP在宮頸鱗癌中的表

3、達(dá)情況目前報(bào)道很少。我們通過(guò)觀察CAP在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞內(nèi)的變化,了解CAP的異常表達(dá)或激活在宮頸鱗癌診斷中的意義,研發(fā)一種新型檢測(cè)試劑盒FSC-811(Fast screeningkit for abnormal cervical cells)并對(duì)其診斷的有效性和敏感性進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
　　目的:
　　本研究的目的是檢測(cè)宮頸酸性磷酸酶的分布,制備宮頸異常細(xì)胞染色試劑盒并檢測(cè)其穩(wěn)定性,最后通過(guò)臨床試驗(yàn)對(duì)試劑盒的有效性和敏感性進(jìn)

4、行評(píng)估。
　　方法:
　　取正常宮頸鱗狀上皮細(xì)胞、Hela細(xì)胞、宮頸癌組織冰凍切片進(jìn)行CAP染色,觀察CAP的表達(dá)。制備試劑盒,篩選固定液。將試劑盒分別存放在不同溫度下,以觀察試劑盒的有效期。將染色工作液存放在4℃,觀察試劑工作液的有效期。臨床收取確診宮頸癌患者的宮頸刮片標(biāo)本,固定前在室溫空氣中放置不同天數(shù)后進(jìn)行CAP染色,觀察標(biāo)本固定前在室溫空氣中存放的時(shí)間對(duì)CAP染色效果的影響。臨床取宮頸癌陽(yáng)性樣本固定后在1×PBS中保

5、存,每周取片檢測(cè),觀察標(biāo)本固定后在1×PBS中保存時(shí)間。將染色后的陽(yáng)性標(biāo)本用30%甘油封片,觀察標(biāo)本染色后甘油封片的著色穩(wěn)定性。選擇30例確診為宮頸鱗癌的住院病人,手術(shù)前采集宮頸涂片,分別進(jìn)行傳統(tǒng)的巴氏染色和CAP檢測(cè)。采用隨機(jī)、雙盲、對(duì)照試驗(yàn)對(duì)FSC-811試劑盒的有效性和敏感性進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:
　　1.正常宮頸組織細(xì)胞、宮頸癌及Hela細(xì)胞CAP的表達(dá)
　　宮頸正常鱗狀上皮細(xì)胞中FSC-811染色陰性;而He

6、la細(xì)胞中FSC-811染色陽(yáng)性,胞漿呈鮮艷的紅色。對(duì)宮頸組織染色發(fā)現(xiàn),宮頸鱗狀上皮表層細(xì)胞未檢測(cè)到CAP表達(dá),而宮頸腺上皮、子宮內(nèi)膜上皮及癌細(xì)胞的胞漿中均檢測(cè)到CAP的表達(dá)。宮頸脫落細(xì)胞涂片中單核-巨噬細(xì)胞FSC-811染色陽(yáng)性。
　　2.固定液的篩選及優(yōu)化
　　分別用福爾馬林(甲醛:雙蒸水=1:9)、混合固定液(65ml丙酮,37%甲醛8ml,25ml枸櫞酸鹽溶液:枸櫞酸18mmol/l,檸檬酸鈉9mmol/l,NaCl

7、12mmol/l)、4%的多聚甲醛、99.5%丙酮、99.5%甲醇、99.7%乙醇來(lái)固定Hela細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定效果較好,配制方便;4%的多聚甲醛、混合固定液固定效果較好,但配制較復(fù)雜;其他試劑固定后染色效果不好。
　　3.CAP染色試劑配方的優(yōu)化
　　將CAP試劑的不同成分配成5種組分和7種組分,然后進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種組分的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于5種組分的配方,故選擇7種組分的配方作為FSC-811的試劑盒組分。<

8、br>　　4.FSC-811的穩(wěn)定性研究
　　七種組分的FSC-811均可在25℃放置5天后轉(zhuǎn)存4℃保存5個(gè)月;在37℃放置3天后轉(zhuǎn)存4℃能保存1個(gè)月;45℃放置3天后轉(zhuǎn)存4℃能保存1個(gè)月。溫度對(duì)試劑的穩(wěn)定性有影響,適當(dāng)溫度有利于試劑的保存。
　　5.染色工作液存放在4℃的穩(wěn)定性
　　工作液在4℃下存放5天后著色效果開(kāi)始下降。該染色工作液宜現(xiàn)配現(xiàn)用。
　　6.宮頸涂片固定前在空氣中存放時(shí)間觀察
　　宮頸癌陽(yáng)

9、性樣本固定前在室溫空氣中放置1天,2天,4天后進(jìn)行CAP染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)本固定前在室溫空氣中放置4天后,染色效果有所下降。
　　7.宮頸涂片固定后在1×PBS中保存時(shí)間觀察
　　取宮頸癌陽(yáng)性樣本固定后在1×PBS中保存,發(fā)現(xiàn)標(biāo)本固定后在1×PBS中可以保存至22天,在此之前染色效果不受影響。
　　8.30%甘油封片的效果觀察
　　將染色后的陽(yáng)性標(biāo)本用30%甘油封片,每月觀察一次,發(fā)現(xiàn)標(biāo)本染色2個(gè)月后有褪色跡象,6

10、個(gè)月后核褪色,細(xì)胞漿褪色明顯。
　　9.FSC-811對(duì)宮頸鱗癌染色效果觀察
　　選擇30例確診為宮頸鱗癌的住院病人,手術(shù)前采集宮頸涂片,分別進(jìn)行傳統(tǒng)的巴氏染色和CAP檢測(cè)。CAP的檢測(cè)采用FSC-811染色試劑盒,細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)紅色物質(zhì)為CAP陽(yáng)性。巴氏染色結(jié)果的判定采用TBS分級(jí)系統(tǒng)。結(jié)果顯示宮頸鱗狀細(xì)胞癌FSC-811染色陽(yáng)性率為100%。
　　10.FSC-811的臨床試驗(yàn)
　　采用FSC-811和巴氏染