DNA甲基化檢測在宮頸癌篩查中的應(yīng)用.pdf

1、本課題將分兩部分進(jìn)行研究和探討:
　　第一部分 宮頸癌篩查的甲基化分子標(biāo)記物的篩選和驗(yàn)證
　　目的：
　　宮頸癌是一種常見的婦科腫瘤，嚴(yán)重危害婦女健康。DNA異常甲基化作為癌癥發(fā)生的早期事件，在從正常宮頸—癌前病變—癌的發(fā)展過程中呈現(xiàn)出階段特異性及累加性。本研究通過分析多個甲基化分子標(biāo)記物的甲基化水平與病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，以篩選出高級別病變特異性的甲基化分子標(biāo)記物。
　　材料和方法：
　　1.結(jié)合文獻(xiàn)及

2、The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析，篩選出宮頸癌特異性的過甲基化腫瘤抑制基因，針對同一基因的多個位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
　　2.應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)在43例宮頸癌組織及27例正常對照的宮頸組織中初步篩選出差異顯著的甲基化位點(diǎn)。
　　3.應(yīng)用實(shí)時定量甲基化PCR(QMSP):
　　(1)在訓(xùn)練集(train set)-267例有明確

3、病理檢查結(jié)果的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中，對初步篩選出的差異顯著的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步篩選。
　　(2)將進(jìn)一步篩選出的甲基化位點(diǎn)，經(jīng)測試集(test set)-224例有明確病理檢查結(jié)果的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本驗(yàn)證，分析其與訓(xùn)練集相關(guān)數(shù)據(jù)的一致性。
　　(3)應(yīng)用焦磷酸測序的方法對進(jìn)一步篩選出的特異性甲基化位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證及分析。
　　結(jié)果：
　　1.綜合分析篩選出甲基化異?；駽CNA1、CADM1、DAPK1、JAM3

4、,設(shè)計(jì)多個位點(diǎn)的引物。經(jīng)引物特異性驗(yàn)證后，選定4個基因的共27個位點(diǎn)進(jìn)行MSP檢測。
　　2.MSP檢測初步篩選出在宮頸癌組織和正常宮頸組織中甲基化程度差異最顯著的5個位點(diǎn)。這5個位點(diǎn)分別為CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、DAPK1-M3及JAM3-M4,其在宮頸癌組織中的甲基化陽性率分別為65.1％(28/43)、74.4％(32/43)、69.8％(30/43)、76.7％(33/43)及86.0％(37

5、/43);在正常組織中的甲基化陽性率分別為22.2％(6/27)、0.0％(0/27)、11.1％(3/27)、7.4％(2/27)及7.4％(2/27)，5個位點(diǎn)組間差異的P值均＜0.001。
　　3.臨床實(shí)踐中的篩查界值一般為高級別病變。當(dāng)界值分別為CIN2和CIN3時，其對應(yīng)的診斷分類為CIN2+/CIN1-（CIN1和正常對照）及CIN3+（CIN3和癌）/CIN2-（CIN2、CIN1和正常對照）。鑒于CIN2的異質(zhì)性，

6、本研究還對診斷分類CIN3+/CIN1-進(jìn)行了分析。
　　在訓(xùn)練集中，經(jīng)QMSP的驗(yàn)證和進(jìn)一步篩選，提示:
　　(1)分析基因位點(diǎn)的甲基化水平與宮頸病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性:①除DAPK1-M3外，CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、JAM3-M4等4個位點(diǎn)在CIN1-和CIN3+兩組間均存在顯著差異;②DAPK1-M2、DAPK1-M3、JAM3-M4等3個位點(diǎn)在CIN1-和CIN2兩組間存在顯著差異;③AM

7、3-M4在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任兩組間都存在顯著差異。
　　(2)應(yīng)用logistic回歸分析基因甲基化位點(diǎn)單獨(dú)或聯(lián)合的診斷效能:①對于CIN3+/CIN1-和CIN3+/CIN2-診斷分類，單獨(dú)應(yīng)用JAM3-M4即可得到最優(yōu)診斷效能;②對于CIN2+/CINl-診斷分類，CADM1-M8（P=0.001）、DAPK1-M3(P=0.038)和JAM3-M4(P=0.011)聯(lián)合的診斷效能最優(yōu)，但是3個基因聯(lián)合的受

8、試者工作特征曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curve，AUC)為0.806,只略高于單獨(dú)應(yīng)用JAM3-M4的AUC(AUC=0.793)?；诖?，為了統(tǒng)一各個診斷分類，我們在后續(xù)的分析及驗(yàn)證中選取了JAM3-M4位點(diǎn)。
　　在測試集中，經(jīng)QMSP驗(yàn)證，提示:
　　對于訓(xùn)練集中的CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/C

9、IN1-診斷分類，JAM3-M4的AUC分別為0.907、0.860和0.793。對于測試集的CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類，JAM3-M4的AUC分別為0.900、0.870和0.765;其診斷效能在訓(xùn)練集和測試集中呈現(xiàn)較高的一致性。
　　4.經(jīng)焦磷酸測序驗(yàn)證，JAM3-M4的甲基化率在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任兩組間都存在顯著差異。
　　結(jié)論：
　　JAM

10、3-M4的甲基化水平隨宮頸病變程度的加重逐漸升高。對于CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類，JAM3-M4在各組間均呈現(xiàn)較一致的、較穩(wěn)定的顯著差異，提示其可成為宮頸高級別病變的分子生物學(xué)標(biāo)記物，在宮頸癌的篩查中有潛在的應(yīng)用價值。
　　第二部分 甲基化分子標(biāo)記物JAM3-M4在宮頸癌篩查中的應(yīng)用
　　目的：
　　宮頸癌作為一個病因相對明確的腫瘤，是WHO唯一建議在世界范圍內(nèi)開展篩

11、查的惡性腫瘤。從HPV感染到宮頸癌一般需要10到20年，這為臨床上宮頸癌的篩查以及在癌前病變階段實(shí)行有效的干預(yù)措施提供了可能。目前應(yīng)用最廣泛的宮頸癌篩查方法為宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測?；诘谝徊糠值难芯浚琂AM3-M4在宮頸癌的篩查中有潛在的應(yīng)用價值。我們接下來將JAM3-M4與常用篩查方法進(jìn)行比較，并分析其在單獨(dú)應(yīng)用、聯(lián)合應(yīng)用及分流應(yīng)用等方面的價值;另外，分析其對異質(zhì)性CIN2的分流作用。
　　材料和方法：
　

12、　1.收集患者的臨床資料，包括患者基本信息、臨床上常用篩查方法（宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查及高危HPV檢測）的結(jié)果;比較常用篩查方法與JAM3-M4的診斷效能。
　　2.在訓(xùn)練集患者中，利用ROC曲線分析JAM3-M4在各種臨床應(yīng)用中的診斷效能（AUC、敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值）;結(jié)合臨床實(shí)踐，研究及探索診斷效能較高、應(yīng)用意義較大的JAM3-M4篩查方案。另外，進(jìn)一步在測試集的患者中驗(yàn)證其診斷效能的一致性。
　　3.對

13、CIN2的活檢病理切片進(jìn)行免疫組化P16染色，結(jié)合CIN2的JAM3-M4的甲基化狀態(tài)，探討兩者的相關(guān)性及JAM3-M4分流CIN2的可行性。
　　結(jié)果：
　　1.與細(xì)胞學(xué)檢查和高危HPV檢測相比，在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中，JAM3-M4能顯著提高診斷的特異性、陽性預(yù)測值。
　　2.在臨床實(shí)踐中，JAM3-M4的以下應(yīng)用有較好前景:
　　(1)分流作用:①

14、分流高危HPV檢測陽性的患者時，與細(xì)胞學(xué)檢查相比，JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異性、陽性預(yù)測值;陰性預(yù)測值也有一定升高;②分流細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASCUS和LSIL的患者時，與高危HPV檢測相比，JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異性、陽性預(yù)測值;③經(jīng)驗(yàn)證，在訓(xùn)練集及測試

15、集中，JAM3-M4分流高危HPV陽性及細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS和LSIL的患者時，診斷效能的一致性較好;④對于19例年齡為30歲以下的ASCUS患者，高危HPV均為陽性;其中15例經(jīng)病理診斷為CIN1-，這些患者的JAM3-M4均為陰性。
　　(2)聯(lián)合作用:①與細(xì)胞學(xué)檢查和高危HPV檢測聯(lián)用相比，JAM3-M4和細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)用在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異

16、性、陽性預(yù)測值;②經(jīng)驗(yàn)證，JAM3-M4在訓(xùn)練集及測試集中，與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)用的診斷效能一致性較好。
　　3.CIN2中，免疫組化P16染色的陽性率為69.9％，JAM3-M4的陽性率為48.8％，兩者的相符率為60.5％。
　　結(jié)論：
　　與常用的篩查方法相比，JAM3-M4能顯著提高診斷效能，在宮頸癌早期篩查中有潛在的應(yīng)用價值。
　　1.JAM3-M4可用于分流高危HPV檢測陽性及細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASCUS(尤

17、其是年齡小于30歲的患者)、LSIL的患者。
　　2.JAM3-M4與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用可提高診斷效能。
　　3.對于臨床上爭議較大的異質(zhì)性強(qiáng)的CIN2,JAM3-M4有一定的分流效能。
　　意義：
　　1.本研究基于甲基化的階段特異性和位點(diǎn)特異性，研究了多個基因的不同位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。首次對包括JAM3基因的M4在內(nèi)的多個位點(diǎn)進(jìn)行研究，同時對宮頸病變的各個階段及多種診斷分類進(jìn)行分析。
　　2.本研究結(jié)合常