羧甲基纖維素對角膜上皮損傷修復(fù)的影響及其機制探討.pdf

1、目的:羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose,CMC)是一種高分子粘性多糖,是人工眼淚的主要組分,能延長藥物在眼球表面的停留時間。研究表明CMC可以明顯改善干眼癥患者的臨床癥狀,并且其效果呈劑量依賴性。通常認(rèn)為CMC可以延長藥物在眼球表面的停留時間是由其物理特性決定的,目前尚不知CMC是否可以直接作用于眼球表面,特別是上皮細(xì)胞,從而影響角膜上皮損傷的修復(fù)。有報道認(rèn)為CMC可以減低LASIK術(shù)后眼球上皮損傷的發(fā)生率,也

2、有人報道配戴隱形眼鏡前滴加CMC滴眼液具有細(xì)胞保護(hù)作用,減輕角膜和結(jié)膜充血,并且使眼部感到更為舒適。盡管CMC發(fā)揮這些保護(hù)作用的確切機制尚不清楚,但這些研究提示CMC可能參與眼球表面上皮損傷的修復(fù)過程。
　　 本研究將采用體外劃傷愈合分析(scratch-wound closure assay)和動物模型觀察CMC對角膜上皮損傷修復(fù)的影響,并探討其可能的機制。
　　 方法:
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):將復(fù)蘇傳代的人角膜

3、邊緣上皮細(xì)胞(humancornea-limbal epithelial,HCLE)用K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)至滿匯合備用。
　　 2、體外劃傷愈合分析:將HCLE細(xì)胞接種于預(yù)先用膠原Ⅰ包被的8孔腔式培養(yǎng)玻片上,制備體外細(xì)胞劃傷愈合分析模型。利用圖像分析軟件系統(tǒng)在不同位置測量劃傷的平均寬度,計算劃傷愈合的百分率并進(jìn)行組間比較。
　　 3、細(xì)胞增殖實驗:將HCLE細(xì)胞按每孔1×104個細(xì)胞接種于黑色96孔培養(yǎng)板上,孵育24小時

4、后,加入含有不同濃度(0,0.02,0.2,2mg/ml)CMC的1:1混合培養(yǎng)基(K-SFM和低鈣的DMEM/F12),分別繼續(xù)培養(yǎng)0、8、24和48小時。室溫下放置2-5分鐘,搖勻測定每孔的熒光強度(波長485/535 nm),熒光強度的數(shù)值與每孔活細(xì)胞數(shù)成正比。
　　 4、細(xì)胞遷移分析:將HCLE細(xì)胞接種于硅化處理的膠筒內(nèi),加入K-SFM培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至單層滿匯合時,加入100μM羥基脲(hydroxyurea)繼

5、續(xù)培養(yǎng)24 h,以阻止細(xì)胞增殖。去掉膠筒,用K-SFM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次,再加入含有和不含有CMC的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后用Diff-Quik試劑對細(xì)胞進(jìn)行固定并染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。
　　 5、細(xì)胞趨化分析:將HCLE細(xì)胞接種于上層腔式培養(yǎng)板內(nèi),然后置于下層腔式培養(yǎng)板內(nèi),加入含有或不含有CMC的K-SFM培養(yǎng)基,同時加入含有2 mg/mL透明質(zhì)酸鈉(HA)的K-SFM培養(yǎng)基作為陽性對照,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)

6、12 h。遷移至膜底的細(xì)胞用消化液溶脫掉,然后用裂解緩沖液裂解細(xì)胞,加入熒光染料與細(xì)胞的核酸結(jié)合,用分光光度計測定熒光強度(波長485/535 nm),熒光強度反映遷移的細(xì)胞數(shù)。
　　 6、細(xì)胞粘附試驗:將HCLE細(xì)胞懸液接種于預(yù)先用纖維連接蛋白(5μg/cm2)、Ⅰ型膠原蛋白(10μg/cm2)和BSA(1％)包被并加入含有或不含有CMC的96孔板內(nèi)培養(yǎng)4 h。每孔加入10μ L WST-1試劑,孵育2 h,用酶標(biāo)儀(450

7、nm的波長)測定每孔的吸光度,粘附細(xì)胞的數(shù)目與吸光度成正比。
　　 7、動物實驗:新西蘭大白兔12只,在手術(shù)造模前2周除去雙眼瞬膜,隨機分為實驗組和對照組,每組各6只。在2組白兔的右眼角膜中央,制成直徑6.0 mm的角膜損傷模型。對照組滴加PBS液,實驗組滴加含1％CMC的PBS液,每日給藥四次。分別于給藥前和給藥后24 h采用角膜熒光素染色的方法觀察創(chuàng)傷愈合情況。利用計算機圖像分析系統(tǒng)(Image J1.33)計算角膜上皮修復(fù)

8、面積。
　　 8、統(tǒng)計學(xué)處理:所有結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way analysis of varialice,ANOVA)及兩兩比較,以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.CMC對HCLE細(xì)胞劃傷愈合的影響:CMC處理組損傷的愈合百分比遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于僅用培養(yǎng)基處理的溶劑對照組(P=0.00952),提示CMC具有促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞損

9、傷愈合的作用。
　　 2.CMC對HCLE細(xì)胞增殖的影響:細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,低濃度CMC對HCLE細(xì)胞的增殖無明顯影響,與溶劑對照組比較無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.01)。然而,用高濃度的CMC分別處理HCLE細(xì)胞24和48小時后,細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制(P=0.008和P=0.004)。但相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示,其細(xì)胞形態(tài)與對照組一致,表明CMC沒有明顯細(xì)胞毒性效應(yīng)。
　　 3.CMC對HCLE細(xì)胞遷移的影響:

10、細(xì)胞遷移分析結(jié)果顯示,與未加CMC的溶劑對照組相比,CMC可以明顯促進(jìn)HCLE細(xì)胞向四周的遷移,而對照組未觀察到細(xì)胞遷移現(xiàn)象。
　　 4.CMC對HCLE細(xì)胞趨化的影響:細(xì)胞趨化實驗結(jié)果顯示,CMC對HCLE細(xì)胞具有趨化作用,且呈濃度依賴性,高濃度CMC誘導(dǎo)的遷移細(xì)胞數(shù)的增加是低濃度CMC的1.5倍。同時,在下層培養(yǎng)板中加入2.0mg/mL透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)作為陽性對照,表明所用細(xì)胞株具有遷移能力。

11、
　　 5.CMC與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合從而促進(jìn)HCLE細(xì)胞的粘附:細(xì)胞粘附實驗的結(jié)果顯示,將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與CMC共同預(yù)孵育,可顯著增加粘附于膠原和纖維連接蛋白的細(xì)胞數(shù)量。而將BSA與CMC的共孵育則不影響HCLE細(xì)胞粘附的數(shù)量。
　　 6.CMC促進(jìn)損傷后兔角膜上皮的再生:動物實驗結(jié)果表明,兔角膜上皮損傷后24小時,CMC治療組的損傷面積小于PBS處理的對照組；CMC治療組角膜缺損減少的平均百分率高于PBS處理的對照組

12、。t檢驗結(jié)果顯示,在分別用CMC和PBS處理24小時后,兩組之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1、CMC具有一定的生物學(xué)功能,體外可刺激單層HCLE細(xì)胞劃傷的愈合,在體內(nèi)可促進(jìn)兔角膜上皮損傷后的修復(fù)過程。
　　 2、低濃度CMC對細(xì)胞增殖沒有影響,高濃度CMC表現(xiàn)出一定的抑制細(xì)胞增殖的作用。
　　 3、CMC對HCLE細(xì)胞的遷移具有較強的促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用一方面表現(xiàn)在CM