體外重建外泌汗腺的初步研究.pdf

1、目的：1、體外培養(yǎng)的汗腺腺上皮細(xì)胞分別接種在Matrigel下表面、上表面、以及Matrigel中，探討以Matrigel為主要基質(zhì)構(gòu)建汗腺樣結(jié)構(gòu)的方法。2、對(duì)已構(gòu)建的汗腺樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，探討其在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)上與正常汗腺的相似性。3、通過(guò)對(duì)鈣離子激動(dòng)劑和阻滯劑對(duì)體外重建的汗腺樣結(jié)構(gòu)鈣通道的影響作用的研究，探討其在功能上與正常汗腺的相似性。 方法：1、將酶消化法分離培養(yǎng)的原代汗腺腺上皮細(xì)胞分別接種在Matrigel下表面、上表面

2、以及Matrigel中，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。2、用倒置相差顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、計(jì)算機(jī)三維重建、電鏡、HE染色及免疫組織化學(xué)法觀察汗腺樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)特性。3、鈣熒光探針Fluo-3對(duì)汗腺樣結(jié)構(gòu)染色，分別在汗腺樣結(jié)構(gòu)中適時(shí)加入鈣離子激動(dòng)劑(氯化乙酰膽堿)和阻滯劑(阿托品)，激光共聚焦顯微鏡觀察其細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化情況。 結(jié)果：1、汗腺腺上皮細(xì)胞接種在Matrigel下表面，立體培養(yǎng)11d形成腔

3、面結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞增殖不明顯；當(dāng)接種在Matrigel上表面時(shí)，立體培養(yǎng)8h，細(xì)胞胞漿伸長(zhǎng)呈絲狀，與鄰近細(xì)胞相連呈腔面或半腔面形；而接種在Matrigel中，三維立體培養(yǎng)2~3d，細(xì)胞分裂增生，增生細(xì)胞彼此緊密排列成立體管腔結(jié)構(gòu)，中間可見(jiàn)明顯腔隙，隨新生細(xì)胞增多，管腔結(jié)構(gòu)逐漸演變?yōu)椴灰?guī)則球形結(jié)構(gòu)。2、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示細(xì)胞團(tuán)呈球形結(jié)構(gòu)，中央有管腔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列富有極性。計(jì)算機(jī)軟件三維重建后從不同角度觀察，細(xì)胞團(tuán)呈不規(guī)則球形結(jié)構(gòu)。透射

4、電鏡下可見(jiàn)含有大量高電子致密度顆粒的細(xì)胞，以及相對(duì)含有較少高電子致密度顆粒、但含有較多線粒體的細(xì)胞；細(xì)胞彼此排列形成管腔結(jié)構(gòu)，其連接處可見(jiàn)指狀突起以及類(lèi)似分泌小管的腔隙。球形結(jié)構(gòu)HE染色示其剖面為單層細(xì)胞相互連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，中間見(jiàn)明顯的腔隙，細(xì)胞呈錐形，胞質(zhì)嗜酸性，淡染，胞核藍(lán)染，稍大，偏向基底部。免疫組織化學(xué)染色示CK18、CEA表達(dá)陽(yáng)性。3、細(xì)胞外液鈣濃度高時(shí)，加入氯化乙酰膽堿后，鈣通道開(kāi)放，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度明顯增加；細(xì)