輻照捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體誘導(dǎo)羊免疫應(yīng)答的初步研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種危害極大的牛羊胃腸道寄生蟲，常常導(dǎo)致羔羊貧血死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來對該寄生蟲病的防控主要采用以藥物治療為主的措施。隨著耐藥蟲株和獸藥殘留等問題的日益嚴(yán)重，迫切需要采用免疫預(yù)防來控制捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病。盡管在抗捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的疫苗研發(fā)上取得了一定的進(jìn)展，但迄今尚無一種可應(yīng)用于現(xiàn)場的疫苗被研發(fā)成功。究其原因可能是我們對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染和免疫的機(jī)理的了解仍不十分清楚，特別是對于來源于蟲體的保護(hù)性組分（細(xì)胞或抗原）及其免

2、疫生物學(xué)特性缺乏全面了解，故而制約了高保護(hù)性疫苗研發(fā)的進(jìn)程。因此，有必要進(jìn)一步開展新的高保護(hù)性免疫原的篩選和鑒定工作。以前的研究顯示，用輻照捻轉(zhuǎn)血矛線蟲幼蟲免疫羊后能誘導(dǎo)其產(chǎn)生對攻擊感染的高保護(hù)性應(yīng)答，而正常的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲幼蟲感染羊后幾乎不能引起宿主的免疫保護(hù)。因此，輻照幼蟲苗成為研究宿主高保護(hù)性免疫機(jī)制的理想模型。我們最近的研究顯示，來源于體外培養(yǎng)的正常和輻照幼蟲分別呈現(xiàn)出正常凋亡和免疫原性細(xì)胞死亡的表型，提示源于輻照和正常幼蟲的細(xì)胞

3、份子具有不同的免疫生物學(xué)特性。但其細(xì)胞和分子機(jī)制尚不十分清楚。外泌體是一種30-100nm的具有獨特結(jié)構(gòu)的囊泡，包含有蛋白和RNA等，具有細(xì)胞間傳遞信息和免疫相關(guān)功能。最近的研究表明，源于寄生原蟲和線蟲的外泌體對宿主的先天免疫具有抑制作用，蠕蟲的排泄分泌物也常常具有抑制宿主免疫應(yīng)答的功能特征。而包括線蟲和吸蟲在內(nèi)的輻照蠕蟲則能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。提示源于正常和輻照蠕蟲幼蟲的外泌體的分子構(gòu)成及其免疫功能很可能存在差異。因此，

4、我們推測，輻照和正常捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體的分子組分及其表達(dá)分布等可能存在差別，這種差異可能導(dǎo)致其具有不同的免疫生物學(xué)功能。但這一假說仍然需要我們用實驗來進(jìn)行驗證。因此我們開展了輻照和正常捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體的分離鑒定及其免疫生物學(xué)功能測定的初步研究工作。
　　本研究通過收集正常和輻照的18d捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲體體外培養(yǎng)12h的上清，經(jīng)超濾濃縮，并使用外泌體分離試劑盒分離外泌體后，用透射電子顯微鏡鑒定外泌體形態(tài)，結(jié)果表明我們成功獲得了外泌體

5、。對上述兩組蟲體外泌體進(jìn)行了Label free蛋白質(zhì)組定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照組來源外泌體高表達(dá)HSP70、HSP90和CRT等危險相關(guān)分子(danger-associated molecular patterns，DAMPs)。體外分別用5μg、20μg兩個濃度外泌體刺激羊PBMC細(xì)胞后，結(jié)果輻照捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體能夠刺激羊的PBMC上調(diào)IFNγ和IL-4等炎性細(xì)胞因子，抑制IL-10抗炎細(xì)胞因子和1L-17調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的表達(dá)，而正

6、常組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲則能夠抑制IFNγ和IL-4等炎性細(xì)胞因子表達(dá)，上調(diào)IL-10抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)量。正常捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體能夠減少PBMC分泌NO，而輻照捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體則能夠增加PBMC分泌NO。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)輻照后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體內(nèi)含有更多的DAMPs相關(guān)因子，且能夠刺激宿主的炎癥反應(yīng)，而正常組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體能夠抑制宿主的炎癥反應(yīng)。提示來源于正常和輻照的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲外泌體的組成和免疫相關(guān)功能存在差異。本研究