轉(zhuǎn)反義APX基因楊樹(shù)的獲得及其抗逆性研究.pdf

1、楊樹(shù)具有分布范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，它在環(huán)境綠化、水土保持、工業(yè)林木及固氮方面均有突出作用。毛白楊作為中國(guó)特有的楊樹(shù)樹(shù)種，具喜陽(yáng)特性，分布范圍廣，是一種重要的生態(tài)防護(hù)林以及工業(yè)用林。毛白楊易受鹽漬、干旱和氧化等多種不利環(huán)境因素的影響，因而對(duì)其抗逆性分子機(jī)理進(jìn)行深入研究具有重要意義。
　　抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。它通過(guò)參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)來(lái)及時(shí)清除植物

2、體內(nèi)的H2O2，特別是清除葉綠體中的H2O2。APX是包含原卟啉IX的血紅素過(guò)氧化物酶，其氨基酸序列中存在酸堿催化域和血紅素結(jié)合域，相對(duì)分子質(zhì)量約為35KD。植物APX基因家族包含4個(gè)亞家族，分別是胞質(zhì)型（cAPX）、線粒體型（mAPX）、葉綠體型（chlAPX）和過(guò)氧化物酶體型（mbAPX）基因亞家族。APX常以單體存在，有幾種cAPX以同二聚體形式存在。本實(shí)驗(yàn)以741毛白楊為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將已構(gòu)建好的反義pBI121-A

3、PX-IV重組表達(dá)載體導(dǎo)入741毛白楊的基因組中，得到轉(zhuǎn)反義APX-IV基因植株，同時(shí)分析研究該基因在楊樹(shù)抗鹽、抗旱以及抗氧化方面的作用。研究結(jié)果如下：
　　1.利用反義APX-IV重組表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化楊樹(shù)，在20 mg/L Kan的選擇壓下篩選出具有Kan抗性的不定芽，再以10 mg/L Kan對(duì)其生根進(jìn)行篩選，最終獲得具有Kan抗性的再生植株。
　　2.提取初步獲得的具有Kan抗性的轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，以

4、ntp-II序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出約700bp目的條帶的植株即為陽(yáng)性植株。PCR結(jié)果顯示，共得到了7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。
　　3.正常條件下，與野生型相比，反義表達(dá) APX植株生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、生根數(shù)量少、根長(zhǎng)勢(shì)較弱。
　　4.鹽處理?xiàng)l件下，從表型上可發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)反義APX-IV基因植株比野生型植株更早的顯示出鹽害癥狀，鹽處理4d后即表現(xiàn)出部分葉片的葉尖變黃、焦枯的現(xiàn)象；測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)APX和GR酶活性升高的幅度均

5、低于野生型植株，APX酶活性也相對(duì)較低。轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)較低的抗氧化酶活性使體內(nèi)積累大量的活性氧，導(dǎo)致其相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量以及H2O2積累量升高的幅度增大，同時(shí)AsA含量、葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量下降速度更快、降幅更大。
　　5.干旱處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因毛白楊較早的表現(xiàn)出葉子卷曲起皺、葉片邊緣壞死等受損癥狀；生理生化指標(biāo)顯示，轉(zhuǎn)基因毛白楊體內(nèi)MDA積累量明顯高于野生型毛白楊，同時(shí)其抗氧化酶活性與抗氧化物質(zhì)的含量均低于