基于微電子阻抗技術(shù)實時監(jiān)測細菌與細胞相互作用方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、病原體與宿主之間的相互作用是復(fù)雜、動態(tài)的過程,它反映了病原體的特性和宿主對于感染的反應(yīng)能力。對病原體與宿主相互作用的機制研究能幫助我們更好地預(yù)防和控制感染性疾病。在過去二十年里,借助于細胞培養(yǎng)和動物模型,我們對病原體與宿主相互作用有了更進一步的了解,但是其內(nèi)在的分子機制還需進一步深入研究。
　　 盡管研究者開發(fā)了很多方法來研究病原體與宿主的相互作用,但其中絕大部分方法都是靜態(tài)的終點法實驗?；谖㈦娮幼杩辜夹g(shù)的細胞監(jiān)測系統(tǒng)可以無標(biāo)

2、記、動態(tài)地監(jiān)測細胞對于外界刺激的反應(yīng)。利用微電子阻抗原理,Roche公司開發(fā)了新一代的無標(biāo)記xCELLigence細胞實時監(jiān)測系統(tǒng)。該系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于細胞學(xué)的研究。本研究中,我們將微電子阻抗技術(shù)應(yīng)用于細菌與宿主相互作用的研究。細胞感染細菌特征圖譜實時反映了細菌與宿主相互作用的整個過程。通過傳統(tǒng)的終點法實驗,我們驗證了感染特征圖譜的特異性和敏感性。結(jié)果顯示,通過對感染特征圖譜的分析能夠為病原體與宿主相互作用的機制研究提供連續(xù)、數(shù)量化

3、的信息。
　　 第一部分基于微電子阻抗技術(shù)實時監(jiān)測沙門氏菌與宿主細胞的相互作用
　　 本部分研究中,我們基于微電子阻抗技術(shù)建立了一種新型、無標(biāo)記、實時監(jiān)測腸道上皮細胞和巨噬細胞對于沙門氏菌感染反應(yīng)的方法。感染后宿主細胞形態(tài)及粘附能力的變化被實時記錄并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息。細胞感染沙門氏菌特征圖譜與傳統(tǒng)方法進行比較也顯示出良好的相關(guān)性和敏感性。我們證明感染圖譜中細胞指數(shù)(Cell Index)的變化與細菌粘附電極、細胞的增殖無關(guān)

4、。免疫熒光、電鏡觀察到了感染過程中宿主細胞的形態(tài)變化,通過抑制微絲或微管蛋白的聚集說明感染特征圖譜主要與細胞骨架形態(tài)變化相關(guān)。感染圖譜也和沙門氏菌感染后細胞的死亡存在關(guān)聯(lián)。通過本部分研究,我們認為基于微電子阻抗技術(shù)實時監(jiān)測細菌與宿主相互作用的方法可以在更真實的生理狀態(tài)下對感染后細胞的反應(yīng)進行研究,體現(xiàn)了傳統(tǒng)方法所不具有的優(yōu)勢。
　　 第二部分基于微電子阻抗技術(shù)實時監(jiān)測細菌與宿主細胞相互作用模型的應(yīng)用
　　 全基因組表達譜

5、芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于宿主對細菌感染反應(yīng)的研究。本部分中,我們利用腸上皮細胞感染沙門氏菌特征圖譜選取了4個時間點進行芯片實驗。芯片數(shù)據(jù)表明大量涉及炎癥和天然免疫的基因在感染過程中被激活。從芯片數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)IL-10細胞因子家族中的一員,白介素24(IL-24)在沙門氏菌感染腸上皮細胞后mRNA水平顯著上升。IL-24 mRNA上升的水平和感染細菌的MOI值呈現(xiàn)正相關(guān)性。MAPK和PI3K信號通路抑制劑能夠顯著抑制感染后IL-24m

6、RNA水平的升高。用IL-24重組蛋白預(yù)處理細胞可以阻止沙門氏菌的穿入而對沙門氏菌粘附不造成影響。IL-24可以促進細胞粘蛋白(Mucins)的表達,顯示其在保護上皮細胞免受細菌感染方面潛在的作用。病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)可以激活哺乳動物免疫細胞產(chǎn)生吞噬,吞噬過程中細胞骨架發(fā)生重構(gòu)。通過xCELLigence系統(tǒng),我們對巨噬細胞吞噬熱滅活沙門氏菌和LPS包被微球的過程進行了實時監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能成功捕捉到吞噬的信號。我們又將感染

7、特征圖譜應(yīng)用與抗生素作用機理的研究。在感染的不同時間點加入不同類型的抗生素可以影響感染特征圖譜,圖譜的改變也反應(yīng)了各種抗生素抑制細菌的特性。最后,我們對獲得的多種細菌的感染圖譜進行比較分析,發(fā)現(xiàn)各圖譜之間存在的相似點和不同點,而這些圖譜說代表的生物學(xué)意義還需更加深入的研究。
　　 本研究中開發(fā)的基于微電子技術(shù)、無標(biāo)記的細菌與細胞相互作用實時監(jiān)測系統(tǒng)為首次報道。結(jié)合日益發(fā)展的細胞學(xué)技術(shù)我們可以克服細胞微生物學(xué)研究領(lǐng)域中有效研究技術(shù)