基于微電子阻抗技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌與細(xì)胞相互作用方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、病原體與宿主之間的相互作用是復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的過(guò)程,它反映了病原體的特性和宿主對(duì)于感染的反應(yīng)能力。對(duì)病原體與宿主相互作用的機(jī)制研究能幫助我們更好地預(yù)防和控制感染性疾病。在過(guò)去二十年里,借助于細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型,我們對(duì)病原體與宿主相互作用有了更進(jìn)一步的了解,但是其內(nèi)在的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。
　　 盡管研究者開發(fā)了很多方法來(lái)研究病原體與宿主的相互作用,但其中絕大部分方法都是靜態(tài)的終點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)。基于微電子阻抗技術(shù)的細(xì)胞監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以無(wú)標(biāo)

2、記、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)于外界刺激的反應(yīng)。利用微電子阻抗原理,Roche公司開發(fā)了新一代的無(wú)標(biāo)記xCELLigence細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)的研究。本研究中,我們將微電子阻抗技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌與宿主相互作用的研究。細(xì)胞感染細(xì)菌特征圖譜實(shí)時(shí)反映了細(xì)菌與宿主相互作用的整個(gè)過(guò)程。通過(guò)傳統(tǒng)的終點(diǎn)法實(shí)驗(yàn),我們驗(yàn)證了感染特征圖譜的特異性和敏感性。結(jié)果顯示,通過(guò)對(duì)感染特征圖譜的分析能夠?yàn)椴≡w與宿主相互作用的機(jī)制研究提供連續(xù)、數(shù)量化

3、的信息。
　　 第一部分基于微電子阻抗技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)沙門氏菌與宿主細(xì)胞的相互作用
　　 本部分研究中,我們基于微電子阻抗技術(shù)建立了一種新型、無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腸道上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)于沙門氏菌感染反應(yīng)的方法。感染后宿主細(xì)胞形態(tài)及粘附能力的變化被實(shí)時(shí)記錄并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息。細(xì)胞感染沙門氏菌特征圖譜與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較也顯示出良好的相關(guān)性和敏感性。我們證明感染圖譜中細(xì)胞指數(shù)(Cell Index)的變化與細(xì)菌粘附電極、細(xì)胞的增殖無(wú)關(guān)

4、。免疫熒光、電鏡觀察到了感染過(guò)程中宿主細(xì)胞的形態(tài)變化,通過(guò)抑制微絲或微管蛋白的聚集說(shuō)明感染特征圖譜主要與細(xì)胞骨架形態(tài)變化相關(guān)。感染圖譜也和沙門氏菌感染后細(xì)胞的死亡存在關(guān)聯(lián)。通過(guò)本部分研究,我們認(rèn)為基于微電子阻抗技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌與宿主相互作用的方法可以在更真實(shí)的生理狀態(tài)下對(duì)感染后細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行研究,體現(xiàn)了傳統(tǒng)方法所不具有的優(yōu)勢(shì)。
　　 第二部分基于微電子阻抗技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用模型的應(yīng)用
　　 全基因組表達(dá)譜

5、芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于宿主對(duì)細(xì)菌感染反應(yīng)的研究。本部分中,我們利用腸上皮細(xì)胞感染沙門氏菌特征圖譜選取了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)。芯片數(shù)據(jù)表明大量涉及炎癥和天然免疫的基因在感染過(guò)程中被激活。從芯片數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)IL-10細(xì)胞因子家族中的一員,白介素24(IL-24)在沙門氏菌感染腸上皮細(xì)胞后mRNA水平顯著上升。IL-24 mRNA上升的水平和感染細(xì)菌的MOI值呈現(xiàn)正相關(guān)性。MAPK和PI3K信號(hào)通路抑制劑能夠顯著抑制感染后IL-24m

6、RNA水平的升高。用IL-24重組蛋白預(yù)處理細(xì)胞可以阻止沙門氏菌的穿入而對(duì)沙門氏菌粘附不造成影響。IL-24可以促進(jìn)細(xì)胞粘蛋白(Mucins)的表達(dá),顯示其在保護(hù)上皮細(xì)胞免受細(xì)菌感染方面潛在的作用。病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)可以激活哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞產(chǎn)生吞噬,吞噬過(guò)程中細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)。通過(guò)xCELLigence系統(tǒng),我們對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熱滅活沙門氏菌和LPS包被微球的過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能成功捕捉到吞噬的信號(hào)。我們又將感染

7、特征圖譜應(yīng)用與抗生素作用機(jī)理的研究。在感染的不同時(shí)間點(diǎn)加入不同類型的抗生素可以影響感染特征圖譜,圖譜的改變也反應(yīng)了各種抗生素抑制細(xì)菌的特性。最后,我們對(duì)獲得的多種細(xì)菌的感染圖譜進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)各圖譜之間存在的相似點(diǎn)和不同點(diǎn),而這些圖譜說(shuō)代表的生物學(xué)意義還需更加深入的研究。
　　 本研究中開發(fā)的基于微電子技術(shù)、無(wú)標(biāo)記的細(xì)菌與細(xì)胞相互作用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)為首次報(bào)道。結(jié)合日益發(fā)展的細(xì)胞學(xué)技術(shù)我們可以克服細(xì)胞微生物學(xué)研究領(lǐng)域中有效研究技術(shù)