甘蔗宿根矮化病病原菌膜蛋白Lxx18460基因的特性研究.pdf

1、關(guān)于甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)的分離培養(yǎng)、多克隆抗體的制備和檢測已進(jìn)行相關(guān)的研究，但有關(guān)甘蔗宿根矮化病病原菌(Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx)中推測為抗σK因子(anti-sigma Kfactor，RskA)的膜蛋白(membraneprotein，MP) Lxx18460基因單克隆抗體的制備、檢測及遺傳轉(zhuǎn)化的研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究在本課題組前期工作的基

2、礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析對該基因的特異性進(jìn)行分析，誘導(dǎo)并純化了去跨膜區(qū)域的Lxx18460基因可讀框349-717序列(385 bp)編碼的蛋白為抗原，通過多次免疫純種BALB/C小鼠，獲得其單克隆抗體;用該單克隆抗體對細(xì)菌總蛋白和感病、健康甘蔗樣品總蛋白進(jìn)行檢測。構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入野生型煙草，檢測得到煙草轉(zhuǎn)基因植株。本研究結(jié)果有助于探討抗oK因子基因的功能及其在Lxx中的作用。主要結(jié)果如下:
　　1、將含有Lxx18460

3、基因的pET-30a質(zhì)粒的菌液，利用IPTG（濃度0.1 mM）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于50 mL的離心管中，放在經(jīng)4℃預(yù)冷的冷凍離心機(jī)內(nèi)，4℃條件下，5000rpm，離心20 min，棄盡上清。并用兩種不同的蛋白純化方法對該蛋白進(jìn)行純化并比較分析，經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定結(jié)果表明，兩種方法均可以純化出目的蛋白，用改進(jìn)的方法純化出的蛋白更純，量更多，并進(jìn)一步透析和濃縮，用紫外分光光度法檢測獲得的濃縮后蛋白質(zhì)量濃度，用來做免

4、疫抗原。
　　2、以誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白為抗原，通過多次免疫純種BALB/C小鼠，獲得了單克隆抗體。ELISA檢測結(jié)果表明，其效價(jià)大于1∶512000。Western blot檢測結(jié)果表明，該基因在細(xì)菌中和感病甘蔗樣品中表達(dá)，在健康甘蔗樣品中幾乎不表達(dá)。
　　3、本研究中通過構(gòu)建了Lxx18460基因的植株表達(dá)載體，構(gòu)建完成后并進(jìn)行了相應(yīng)驗(yàn)證，表明載體可以用于下一步轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了表型觀察，與