宿根矮化病病原菌特性及其侵染后的甘蔗生理和基因差異表達(dá).pdf

1、甘蔗宿根矮化病是各個(gè)植蔗區(qū)普遍發(fā)生的病害，是甘蔗產(chǎn)量重要的限制因素之一，嚴(yán)重影響甘蔗生長(zhǎng)，尤其是宿根蔗，造成甘蔗生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失。在高感品種上的發(fā)病率達(dá)93％，由此產(chǎn)生的甘蔗產(chǎn)量損失達(dá)27％。目前并沒(méi)有有效的藥劑來(lái)防治此病，最經(jīng)濟(jì)有效的防治措施是種植抗病品種，但至今并沒(méi)有完全有效的抗病品種。此病由革蘭氏陽(yáng)性菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起，Lxx在體外培養(yǎng)需要豐富的營(yíng)養(yǎng)、特制的培養(yǎng)基，是公認(rèn)的難于實(shí)現(xiàn)體外

2、培養(yǎng)的致病細(xì)菌，因此也限制了Lxx與寄主間互作機(jī)理的研究。本研究從高感品種Badila中分離培養(yǎng)得到Lxx純培養(yǎng)物，電子顯微鏡觀察了Lxx內(nèi)外部形態(tài)特征，利用高通量測(cè)序技術(shù)比較了與巴西菌株LxxCTCB07的基因組差異，并觀察了自然染病條件下葉片的解剖結(jié)構(gòu)和葉綠體形態(tài);利用分離培養(yǎng)的Lxx純培養(yǎng)物接種健康脫毒甘蔗，比較染病與健康蔗株間光合作用、防御酶活性、內(nèi)源激素以及基因表達(dá)上的差異，結(jié)果如下:
　　1.用MSC培養(yǎng)基從高感品種中

3、分離培養(yǎng)得到Lxx，經(jīng)16S-23S基因間區(qū)序列上的特異性引物PCR擴(kuò)增、測(cè)序比對(duì)后確認(rèn)分離培養(yǎng)物是Lxx，并命名為L(zhǎng)xxGXBZ01，將擴(kuò)增片段上傳至NCBI，登錄號(hào)為KR132244。在掃描電鏡下觀察到Lxx菌體定殖于導(dǎo)管紋孔及孔壁中，許多圓形顆粒狀物質(zhì)粘附于導(dǎo)管內(nèi)的紋孔及導(dǎo)管壁。用石蠟切片方法觀察+1葉橫切面，發(fā)現(xiàn)染病葉片的泡狀細(xì)胞圓潤(rùn)，上窄下寬，相比于健康葉片的要大一些。用透射電鏡觀察葉片的葉綠體，發(fā)現(xiàn)染病葉片的葉綠體較小，形態(tài)

4、從長(zhǎng)橢圓形轉(zhuǎn)變成短橢圓形;基粒片層和類囊體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，但嗜鋨顆粒增加，淀粉粒減少，葉綠體被膜被破壞。
　　2.收集LxxGXBZ01菌體，提取基因組DNA，通過(guò)Illumina Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序，共產(chǎn)出262M數(shù)據(jù)，得到基因組大小為2446908 bp，GC含量67.94％，共有82個(gè)scaffold，2724個(gè)contig，scaffold和contig的N50分別為53480 bp、1088 bp;N90分別為1

5、5639bp、405 bp。上傳至NCBI，登錄號(hào)為L(zhǎng)FYU00000000。以巴西分離得到的菌株LxxCTCB07（登錄號(hào):AE16822.1）的基因組全序列作為參考序列，進(jìn)行比較基因組分析，得到覆蓋度為99.99％，平均深度為130。LxxGXBZ01基因組中共有13個(gè)SNP，其中同義突變3個(gè)，非同義突變2個(gè)，2個(gè)插入突變，6個(gè)缺失突變，發(fā)生在CDS的移碼突變有2個(gè)。利用EzBioclound在線軟件分析了LxxGXBZ01與Lxx

6、CTCB07的ANI值，為93.61％，說(shuō)明兩個(gè)菌株間有較高的相似性。
　　3.用Lxx純培養(yǎng)菌液接種健康脫毒的Badila、GT11和GT29種莖，結(jié)果表明，受Lxx侵染后，品種GT11和Badila的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間二氧化碳和蒸騰速率隨著侵染時(shí)間的不同而呈現(xiàn)不同的下降趨勢(shì);品種GT29染病葉片的PEPC活性降低;而Lxx對(duì)O2·-含量、SOD和POD活性的影響，因不同的甘蔗品種和不同的接種時(shí)間而有不同的變化。染病蔗汁

7、中的Brix與健康蔗汁無(wú)差異。
　　4.分別在新植期和宿根期的甘蔗工藝成熟期，分析了GT11和Badila受Lxx侵染后的新植和宿根蔗莖基部和葉片中赤霉素、脫落酸和吲哚乙酸含量的情況。結(jié)果表明，Lxx侵染后，GT11新植蔗莖中的GA3、ABA含量顯著升高，宿根蔗莖中的GA3、ABA含量顯著降低，而IAA顯著升高;新植蔗葉片中的GA3、IAA含量顯著降低，宿根蔗葉片中的GA3顯著升高。Badila新植蔗莖中的ABA、IAA含量顯著下

8、降，宿根蔗莖中ABA含量顯著降低、IAA含量顯著升高;新植蔗葉片中GA3、IAA含量顯著降低，宿根蔗葉片中GA3、 ABA、IAA含量均無(wú)明顯差異。這說(shuō)明Lxx對(duì)甘蔗內(nèi)源激素的影響因品種、部位、種植年限不同而有差異，且甘蔗對(duì)Lxx脅迫的響應(yīng)涉及多種激素間的相互作用。
　　5.用Lxx純培養(yǎng)菌液接種健康脫毒的Badila種莖，分別于接種60 d、90 d后，砍取莖基部，提取RNA并構(gòu)建RNA-seq測(cè)序文庫(kù)，隨后在Illimina

9、Hiseq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果共得到299199個(gè)轉(zhuǎn)錄本和156713個(gè)Unigene，轉(zhuǎn)錄本和Unigene的N50分別為1875 bp和1348 bp，N90分別為442 bp和279 bp。健康與染病蔗株間在處理60 d后共有37個(gè)差異表達(dá)基因，染病蔗株上調(diào)基因9個(gè)，下調(diào)基因28個(gè);處理90 d后共有371個(gè)差異表達(dá)基因，染病蔗株上調(diào)基因267個(gè)，下調(diào)基因104個(gè)。這些差異基因中與植物抗逆響應(yīng)關(guān)系密切的Pathway有苯丙烷代謝，