甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 脊柱骨折脫位或脊髓慢性壓迫均可造成脊髓的缺血再灌注損傷。脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是指脊髓損傷等導(dǎo)致脊髓缺血的因素去除后，脊髓恢復(fù)血供，神經(jīng)功能不僅得不到改善，反而在原缺血損傷基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷在脊髓損傷后的繼發(fā)損傷(SecondarySCI)中扮演了重要角色。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)廣泛的存在于脊髓缺血再灌注后引起的神經(jīng)損傷的病理過(guò)程中。而這一過(guò)程給

2、當(dāng)前治療脊髓缺血再灌注損傷提供了一個(gè)潛在的介入點(diǎn)。HMGB1是一組與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白，由于在凝膠電泳時(shí)具有高移動(dòng)性，所以被命名為高遷移性蛋白組(highmobilitygroup)，其中的HMGB1在細(xì)胞發(fā)生壞死時(shí)擴(kuò)散到細(xì)胞外液中。一旦被分泌或擴(kuò)散到細(xì)胞外夜中，HMGB1能夠開啟包含HMGB1/TLR-4/NF-κB的危險(xiǎn)信號(hào)分子通路，加劇炎癥反應(yīng)。甘草甜素(Glycyrrhizin)為中藥甘草有效成分的第3代提取物，主要成分為α體甘草

3、甜素鹽成分，具有較強(qiáng)的非特異性抗炎作用和類激素作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小鼠脊髓缺血再灌注模型，觀察小鼠缺血再灌注模型后脊髓組織中HMGB1、RAGE、TLR-4和NF-κB的活性形式磷酸化的P65(PP65)的變化以及甘草甜素對(duì)其干預(yù)的影響，探討甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用機(jī)制，為其在臨床治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 選取第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室飼養(yǎng)的雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。通

4、過(guò)顯微鏡下開胸手術(shù)，顯微血管夾夾閉法阻斷小鼠的主動(dòng)脈弓(位于左頸總動(dòng)脈與左鎖骨下動(dòng)脈之間)、左鎖骨下動(dòng)脈(起始部，位于胸廓內(nèi)動(dòng)脈分支之前段)來(lái)造成C57BL/6小鼠的脊髓缺血，缺血時(shí)間分別為10min及15min組，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15min組建模成功率更高，后所有實(shí)驗(yàn)組均采取15min缺血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組(每組n=6)：實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組、對(duì)照組(阻斷缺血后給予等量PBS)和甘草甜素組(10mg/kg，阻斷缺血后給藥)。術(shù)后實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物均同條件飼養(yǎng)，選取術(shù)后3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天共六個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，通過(guò)心臟甲醛灌注法處死，完整取下小鼠全段脊髓組織，液氮冷凍保存材料。術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)通過(guò)后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法來(lái)定性研究。小鼠脊髓組織病理學(xué)觀察通過(guò)使用H&E染色發(fā)進(jìn)行比較對(duì)照研究。通過(guò)RT-PCR或ELISA檢測(cè)法對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)再灌注損傷后脊髓組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子在mRNA水平或蛋白水平及其受體表達(dá)的變化進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)Western-blot方法檢測(cè)測(cè)

6、定NF-κB的活性亞體pp65的活性，從而定量分析其活化情況。本實(shí)驗(yàn)所有的量化數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析法。對(duì)于神經(jīng)功能缺損評(píng)分等定性數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)法進(jìn)行兩組之間的比較。定義P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 甘草甜素組與對(duì)照組相比，顯著改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能，減少脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，降低NF-κB的激活和隨后的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)(TNF和IL

7、-1β)，減輕缺血后脊髓組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。針對(duì)HMGB1的特異性阻斷治療也減少了其自身的表達(dá)。HMGB1作為公認(rèn)的一個(gè)關(guān)鍵因素介導(dǎo)著體外和體內(nèi)神經(jīng)元損傷的細(xì)胞反應(yīng)。在我們的模型中，HMGB1在非常早期的階段即顯著增加，在缺血再灌注損傷一天后達(dá)到高峰。直到第7天它們?nèi)员３衷诟咚?，雖然略有逐漸減少的趨勢(shì)。我們還發(fā)現(xiàn)，HMGB1受體RAGE和TLR4的表達(dá)水平在此過(guò)程中同時(shí)明顯升高。放大后的HMGB1的信號(hào)通路反饋機(jī)制及其介導(dǎo)的炎癥

8、反應(yīng)導(dǎo)致了脊髓損傷的進(jìn)一步加劇。然而，這也表明，在早期針對(duì)性的抑制HMGB1可能提供極大的好處，并作為治療缺血再灌注損傷有吸引力的策略。在日本，甘草甜素作為一種傳統(tǒng)中藥制劑多年來(lái)已被用于對(duì)乙型和丙型肝炎的治療。后來(lái)，甘草甜素發(fā)現(xiàn)可以與HMGB1結(jié)合，抑制其細(xì)胞因子作用，提示在炎癥反應(yīng)相關(guān)疾病中的廣泛應(yīng)用前景。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，甘草甜素能抑制NF-κB活化及炎性細(xì)胞因子的后續(xù)產(chǎn)生。缺血再灌注后HMGB1的主要來(lái)源仍然不明朗。在早期缺血后，可能

9、主要來(lái)源于薄壁細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損或壞死的釋放，以及從細(xì)胞核內(nèi)主被動(dòng)分泌而來(lái)。這些HMGB1刺激受傷組織中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子、IL-1、IL-8等。，反過(guò)來(lái)這些細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞自分泌或旁分泌方式的方式來(lái)刺激HMGB1的分泌。因此，在缺血再灌注脊髓損傷的晚期，局部存在或聚集的巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1的可能可能是Hmgb1維持高水平的主要原因，并導(dǎo)致了炎癥相關(guān)疾病的持久存在

10、。甘草甜素不僅在早期階段阻斷HMGB1的活性，同時(shí)也減少其在后期的表達(dá)水平。NF-κB是一個(gè)關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多炎癥相關(guān)的基因，并肯定與脊髓缺血再灌注損傷呈正相關(guān)。在本研究中，我們也觀察到NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的增加以及激活和缺血再灌注后的核易位。HMGB1的啟動(dòng)、激活和易位可能代表下游危險(xiǎn)信號(hào)通路的打開及反饋性放大。甘草甜素治療通過(guò)抑制NF-κB活化，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 甘草甜素對(duì)小