甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 脊柱骨折脫位或脊髓慢性壓迫均可造成脊髓的缺血再灌注損傷。脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是指脊髓損傷等導致脊髓缺血的因素去除后，脊髓恢復血供，神經(jīng)功能不僅得不到改善，反而在原缺血損傷基礎上進一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷在脊髓損傷后的繼發(fā)損傷(SecondarySCI)中扮演了重要角色。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應廣泛的存在于脊髓缺血再灌注后引起的神經(jīng)損傷的病理過程中。而這一過程給

2、當前治療脊髓缺血再灌注損傷提供了一個潛在的介入點。HMGB1是一組與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白，由于在凝膠電泳時具有高移動性，所以被命名為高遷移性蛋白組(highmobilitygroup)，其中的HMGB1在細胞發(fā)生壞死時擴散到細胞外液中。一旦被分泌或擴散到細胞外夜中，HMGB1能夠開啟包含HMGB1/TLR-4/NF-κB的危險信號分子通路，加劇炎癥反應。甘草甜素(Glycyrrhizin)為中藥甘草有效成分的第3代提取物，主要成分為α體甘草

3、甜素鹽成分，具有較強的非特異性抗炎作用和類激素作用。本實驗運用小鼠脊髓缺血再灌注模型，觀察小鼠缺血再灌注模型后脊髓組織中HMGB1、RAGE、TLR-4和NF-κB的活性形式磷酸化的P65(PP65)的變化以及甘草甜素對其干預的影響，探討甘草甜素在脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用機制，為其在臨床治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論基礎。
　　 方法：
　　 選取第二軍醫(yī)大學免疫學教研室飼養(yǎng)的雄性C57BL/6小鼠作為實驗動物。通

4、過顯微鏡下開胸手術(shù)，顯微血管夾夾閉法阻斷小鼠的主動脈弓(位于左頸總動脈與左鎖骨下動脈之間)、左鎖骨下動脈(起始部，位于胸廓內(nèi)動脈分支之前段)來造成C57BL/6小鼠的脊髓缺血，缺血時間分別為10min及15min組，通過預實驗檢驗發(fā)現(xiàn)15min組建模成功率更高，后所有實驗組均采取15min缺血時間。實驗動物分為三組(每組n=6)：實驗組、假手術(shù)組、對照組(阻斷缺血后給予等量PBS)和甘草甜素組(10mg/kg，阻斷缺血后給藥)。術(shù)后實驗

5、動物均同條件飼養(yǎng)，選取術(shù)后3小時、6小時、12小時、24小時、3天、7天共六個時間節(jié)點，通過心臟甲醛灌注法處死，完整取下小鼠全段脊髓組織，液氮冷凍保存材料。術(shù)后運動功能評價通過后肢運動功能評分法來定性研究。小鼠脊髓組織病理學觀察通過使用H&E染色發(fā)進行比較對照研究。通過RT-PCR或ELISA檢測法對不同時間節(jié)點再灌注損傷后脊髓組織內(nèi)炎性細胞因子在mRNA水平或蛋白水平及其受體表達的變化進行了測定。通過Western-blot方法檢測測

6、定NF-κB的活性亞體pp65的活性，從而定量分析其活化情況。本實驗所有的量化數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD。統(tǒng)計數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析法。對于神經(jīng)功能缺損評分等定性數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗法進行兩組之間的比較。定義P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 甘草甜素組與對照組相比，顯著改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能，減少脊髓前角運動神經(jīng)元細胞凋亡，降低NF-κB的激活和隨后的炎性細胞因子的表達(TNF和IL

7、-1β)，減輕缺血后脊髓組織內(nèi)的中性粒細胞的浸潤。針對HMGB1的特異性阻斷治療也減少了其自身的表達。HMGB1作為公認的一個關(guān)鍵因素介導著體外和體內(nèi)神經(jīng)元損傷的細胞反應。在我們的模型中，HMGB1在非常早期的階段即顯著增加，在缺血再灌注損傷一天后達到高峰。直到第7天它們?nèi)员３衷诟咚?，雖然略有逐漸減少的趨勢。我們還發(fā)現(xiàn)，HMGB1受體RAGE和TLR4的表達水平在此過程中同時明顯升高。放大后的HMGB1的信號通路反饋機制及其介導的炎癥

8、反應導致了脊髓損傷的進一步加劇。然而，這也表明，在早期針對性的抑制HMGB1可能提供極大的好處，并作為治療缺血再灌注損傷有吸引力的策略。在日本，甘草甜素作為一種傳統(tǒng)中藥制劑多年來已被用于對乙型和丙型肝炎的治療。后來，甘草甜素發(fā)現(xiàn)可以與HMGB1結(jié)合，抑制其細胞因子作用，提示在炎癥反應相關(guān)疾病中的廣泛應用前景。同時我們發(fā)現(xiàn)，甘草甜素能抑制NF-κB活化及炎性細胞因子的后續(xù)產(chǎn)生。缺血再灌注后HMGB1的主要來源仍然不明朗。在早期缺血后，可能

9、主要來源于薄壁細胞和非實質(zhì)細胞受損或壞死的釋放，以及從細胞核內(nèi)主被動分泌而來。這些HMGB1刺激受傷組織中的單核細胞、巨噬細胞或中性粒細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，包括腫瘤壞死因子、IL-1、IL-8等。，反過來這些細胞因子通過誘導單核細胞和巨噬細胞自分泌或旁分泌方式的方式來刺激HMGB1的分泌。因此，在缺血再灌注脊髓損傷的晚期，局部存在或聚集的巨噬細胞主動分泌HMGB1的可能可能是Hmgb1維持高水平的主要原因，并導致了炎癥相關(guān)疾病的持久存在

10、。甘草甜素不僅在早期階段阻斷HMGB1的活性，同時也減少其在后期的表達水平。NF-κB是一個關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多炎癥相關(guān)的基因，并肯定與脊髓缺血再灌注損傷呈正相關(guān)。在本研究中，我們也觀察到NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達的增加以及激活和缺血再灌注后的核易位。HMGB1的啟動、激活和易位可能代表下游危險信號通路的打開及反饋性放大。甘草甜素治療通過抑制NF-κB活化，減少炎性細胞因子的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 甘草甜素對小