大菱鲆干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF-7)基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我國北方一種重要的海水養(yǎng)殖魚類品種。近年來,隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大,病害問題日益嚴(yán)重,尤其是病毒性疾病如大菱鲆紅體病給我國大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。作為多功能轉(zhuǎn)錄因子,干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factors,IRFs),特別是IRF-3和IRF-7,在干擾素(Interferon,IFN)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病原體的免疫反應(yīng)等方面起到非常重要的作

2、用。因此,對大菱鲆干擾素系統(tǒng)的深入研究在大菱鲆病毒性疾病的防治上具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。目前,大菱鲆IRF-3(SmIRF-3)和IRF-7(SmIRF-7)尚未被克隆和研究。
　　 本文采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、同源PCR克隆(HomologyPCR Cloning)和cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù),從大菱鲆頭腎組織中獲得IRF-3和I

3、RF-7基因的全長cDNA和基因組DNA。大菱鲆IRF-3 cDNA(GenBank登錄號:HQ424131)全長為2820bp,完整開放閱讀框長1398bp,編碼466個(gè)氨基酸,5’非翻譯區(qū)長242bp,3’非翻譯區(qū)長1180bp。IRF-3基因組DNA全長bp,包括11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。大菱鲆IRF-7基因cDNA(GenBank登錄號:HQ424129)全長為1976bp,完整開放閱讀框長1308bp,編碼436個(gè)氨基酸,5

4、’非翻譯區(qū)長13bp,3’非翻譯區(qū)長646bp。IRF-7基因組DNA(GenBank登錄號:HQ424130)全長3999bp,包括10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。同其他魚類IRF-3和IRF-7編碼的氨基酸類似,大菱鲆IRF-3和IRF-7編碼的氨基酸序列也具有典型的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,DBD)、IRF相關(guān)域(IRF association domain,IAD)和絲氨酸富含域(Serine-rich do

5、main,SRD)。與其他脊椎動(dòng)物的IRF-3和IRF-7氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),大菱鲆IRF-3和IRF-7與它們具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明大菱鲆IRF-3和IRF-7屬于IRF-3亞家族的兩個(gè)不同成員,它們可能來自共同的祖先基因。
　　 采用RT-PCR方法對IRE-3和IRF-7這兩個(gè)基因在健康大菱鲆腦、鰓、胃、腸、心、頭腎、體腎、肝、脾、性腺、肌肉和皮膚12個(gè)組織中表達(dá)分布情況進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IRF-3基因

6、在頭腎、體腎和脾中表達(dá)水平較高,中等程度表達(dá)于鰓和腸,在胃、心、肝中表達(dá)較弱,而在腦、性腺、肌肉和皮膚中幾乎沒有表達(dá)。大菱鲆IRF-7基因在所研究的組織中均有較明顯的表達(dá)。其中,高水平表達(dá)于腦、胃、腸、心、頭腎、體腎、脾和性腺中,中等程度表達(dá)于鰓、肝、肌肉和皮膚中。
　　 為了解大菱鲆IRF-3和IRF-7基因的表達(dá)規(guī)律及其在干擾素信號系統(tǒng)中的地位與作用,實(shí)驗(yàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)用大菱鲆紅體病毒(TRBIV)感染健康的大菱鲆,并檢測感

7、染0、1、2、3、4、5、7天后SmIRF-3、SmIRF-7和Mx三個(gè)基因在頭腎、脾、鰓和肌肉組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)TRBIV感染的大菱鲆頭腎和肌肉組織中,IRF-3、IRF-7和Mx三個(gè)基因均上調(diào)表達(dá)。在頭腎中,SmIRF-3、SmIRF-7和Mx表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在病毒感染后的第一天、第二天和第四天,表達(dá)量是對照水平的10倍、12倍和6倍。在脾中,SmIRF-3和Mx表達(dá)峰值均出現(xiàn)在病毒感染后的第一天,表達(dá)量是對照水平的

8、16倍和4.7倍。在鰓中,SmIRF-3和Mx表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在病毒感染后的第二天和第四天,表達(dá)量是對照水平的3.7倍和2.8倍。在肌肉中,SmIRF-7和Mx表達(dá)峰值分別出現(xiàn)在病毒感染后的第二天和第五天,表達(dá)量是對照水平的4.5倍和2.8倍,這些結(jié)果呈現(xiàn)出一定規(guī)律性,表明IRF-3和IRF-7在魚類抗病毒反應(yīng)中起著重要的作用。
　　 本文成功克隆到大菱鲆IRF-3和7的全長cDNA序列和基因組序列,并對其表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)的分析