弓形蟲感染誘導(dǎo)非特異性抗腫瘤效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、目的：觀察RH株弓形蟲感染鼠血清在體外對小鼠黑色素瘤細胞(B16細胞)增殖以及凋亡的影響，進一步探討弓形蟲感染抑制腫瘤生長的機制。探討紫外線輻照致弱RH株弓形蟲速殖子的條件以及致弱弓形蟲的生物學(xué)特性，為下一步以致弱速殖子抗腫瘤實驗做準備。觀察致弱RH株弓形蟲速殖子誘導(dǎo)的免疫對C57BL/6J小鼠體內(nèi)黑色素瘤生長的影響。
　　方法：1將40只昆明小鼠隨機分為8組，每組5只，分別經(jīng)腹腔注射4×106/ml RH株弓形蟲速殖子、生理鹽水

2、0.1ml，4天后心臟采血，分離血清。①不同濃度的感染鼠血清與B16細胞作用24h、48h，MTT實驗檢測OD值，計算細胞生長抑制率。②不同濃度感染鼠血清與B16細胞作用24h后，HE染色觀察細胞形態(tài)，瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　2以253.7nm、30W紫外線燈作為輻照源在室溫下輻照一定濃度的弓形蟲速殖子，垂直照射距離為40cm，照射時間分別為0、1、3、5、10、20、30、40 min。①臺盼藍拒染法觀察速

3、殖子活力。②用輻照速殖子感染體外培養(yǎng)的B16細胞，觀察輻照速殖子侵入細胞以及在細胞內(nèi)增殖的情況。③輻照速殖子經(jīng)腹腔接種小鼠，觀察小鼠存活時間，判斷其在小鼠體內(nèi)增殖情況。④線粒體呼吸實驗。⑤輻照5min RH株速殖子免疫小鼠，60天后用同株速殖子攻擊，觀察小鼠存活時間。
　　3紫外線輻照致弱RH株弓形蟲速殖子經(jīng)腹腔接種免疫C57BL/6J小鼠二次，免疫間隔時間為7天。分別在第二次免疫的當天、免疫后7天和21天皮下注射B16細胞。于注

4、射B16細胞21天后處死小鼠，測量腫瘤的體積、重量，計算抑瘤率，觀察致弱速殖子免疫對小鼠體內(nèi)黑色素瘤生長的影響。
　　結(jié)果：1 RH株弓形蟲感染鼠血清在體外對B16細胞效應(yīng)的實驗結(jié)果：①不同濃度感染鼠血清與B16細胞分別作用24h、48h，各實驗組吸光度與對照組比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。不同濃度感染鼠血清作用24h，對B16細胞增殖的抑制率分別為8.75％、14.76%、23.37%；作用48h，對 B16細胞增殖的抑

5、制率為14.94%、24.90%、40.13%。細胞增殖抑制率與感染鼠血清濃度和作用時間有關(guān)，隨著血清濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率增加。②不同濃度感染鼠血清作用24h后，HE染色鏡檢可見B16細胞生長密度降低，細胞核出現(xiàn)濃染、核固縮；提取細胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型DNA梯形條帶；流式細胞儀檢測，對照組和10%、20%感染血清組的細胞凋亡率分別為5.5233±2.9579%、26.4933±3.8200%、44.74

6、33±3.4807%，感染血清組與對照組細胞凋亡率比較具有顯著差異(P＜0.05)，10%、20%感染血清組之間比較差異具有顯著性(P＜0.05)。2紫外線輻照致弱弓形蟲的實驗結(jié)果：①未經(jīng)輻照速殖子活力為99.0%，輻照30min速殖子活力為90.5%，隨著輻照時間延長，速殖子活力略有下降。當輻照時間延長到40min時，速殖子全部失去活力。②輻照0～30min速殖子均能夠侵入B16細胞。③輻照1min速殖子可以在B16細胞和小鼠體內(nèi)增殖

7、，小鼠平均存活時間為6天；輻照3～30min速殖子接種小鼠在30天實驗觀察期內(nèi)全部存活，且在 B16細胞內(nèi)無增殖。④與未經(jīng)輻照的速殖子相比，輻照并沒有影響速殖子的新陳代謝功能。⑤輻照速殖子免疫小鼠在受到攻擊感染后存活時間為192±18h，對照組存活時間為144±15h，兩組之間比較差異具有顯著性(P＜0.05)。3致弱弓形蟲免疫的抑瘤效應(yīng)的實驗結(jié)果：實驗組小鼠腫瘤體積分別為1.02±0.35 cm3、1.30±0.33 cm3、1.45

8、±0.29cm3，與對照組(2.07±0.78cm3)比較有顯著差異(P＜0.05)。實驗組腫瘤重量分別為0.8283±0.4311g、1.2417±0.3468g、1.5150±0.4890g，對照組腫瘤重量為3.3967±0.5881g，各實驗組與對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，但各實驗組之間比較無顯著差異(P＞0.05)。各實驗組抑瘤率分別為76.52%、63.45%、55.40%。
　　結(jié)論：1 RH株弓形蟲感染小鼠