控制Rt-qPCR中非特異性擴(kuò)增的初步研究.pdf

1、目的：
　　1.尋找規(guī)避引物二聚體產(chǎn)生的一種引物設(shè)計(jì)策略。
　　2.總結(jié)第二種生成引物二聚體的重要方式。
　　3.檢測自制優(yōu)化試劑對控制RT-qPCR非特異性擴(kuò)增的效果。
　　4.用乙肝病毒DNA定量檢測體系驗(yàn)證控制非特異性擴(kuò)增方法的效果。
　　方法：
　　1.手工設(shè)計(jì)具有從5'到3'上連續(xù)多個堿基相同的引物對，采用無模板SG-Ⅰ(SYBR Green-Ⅰ)RT-qPCR測試它們抑制引物二聚體合成的規(guī)

2、律，探究能夠規(guī)避產(chǎn)生的引物二聚的優(yōu)化設(shè)計(jì)方案，并在天然序列的引物設(shè)計(jì)過程中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　2.利用DNAMAN3.0和Primer Premier5.0等軟件，依據(jù)天然模板的核苷酸設(shè)計(jì)存在連續(xù)多個堿基反方向互補(bǔ)的引物對。采用無模板SG-Ⅰ RT-qPCR測試它們促進(jìn)引物二聚體合成的規(guī)律，探索第二種產(chǎn)生引物二聚體的主要機(jī)制。
　　3.依據(jù)引物的核苷酸設(shè)計(jì)與它們的3'末端反方向互補(bǔ)的短寡核苷酸人工序列，然后測試它們經(jīng)過高溫-低溫

3、-中溫循環(huán)處理后對引物二聚體的橋接作用，驗(yàn)證生成引物二聚體的第二種主要的機(jī)制。
　　4.采用傳統(tǒng)的納米顆粒制作工藝合成控制RT-qPCR非特異性的試劑，利用SG-ⅠRT-qPCR測試其對特異性和引物二聚體累積的影響。
　　5.配制多種銨鹽液，驗(yàn)證其對RT-qPCR控制非特異性的作用。
　　6.采用中間偏3'末端從5'到3'多堿基相同的方案設(shè)計(jì)引物，建立經(jīng)濟(jì)、簡便的SG-Ⅰ RT-qPCR乙肝病毒DNA定量檢測的高靈敏度

4、體系。
　　7.以249例臨床血清樣本為實(shí)驗(yàn)的對象，通過2種化學(xué)方法:本實(shí)驗(yàn)室新建的SG-Ⅰ法和已經(jīng)投入臨床應(yīng)用的Taq Man法RT-qPCR，根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得兩方法的原始濃度，評價(jià)SG-Ⅰ RT-qPCR定量新體系。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:使用SPSS15.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，針對配對資料采取卡方檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.測試人工設(shè)計(jì)的引物（寡核苷酸鏈）對后發(fā)現(xiàn):上/下游引物含有的核苷酸在從5'到3

5、'（都是5'-3'）完全相同的引物對有83.3％(10/12)可以在45個循環(huán)中不合成引物二聚體;連續(xù)多個堿基從5'到3'相同的位置在偏3'末端(Ct值為39～42)和在3'末端(Ct值＞42)可以規(guī)避生成引物二聚體，后者的抑制作用更明顯。
　　2.下游引物的3'末端連續(xù)有6個堿基與上游引物的5'末端或中間的6個堿基連續(xù)的反方向互補(bǔ)時(shí)均不會抑制引物二聚體的合成（Ct值＜32）。
　　3.短寡核苷酸經(jīng)過預(yù)處理之后對引物二聚體的

6、合成有干擾，高溫預(yù)處理后則有橋接、促進(jìn)的作用（Ct值＜26）。
　　4.Home-made納米顆粒溶液和各種銨鹽溶液表現(xiàn)為不阻礙特異性(△Ct≈0)兼顧控制非特異性(△Ct＞0)。
　　5.本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的SG-Ⅰ RT-qPCR HBV DNA定量檢測方法對實(shí)驗(yàn)樣本的的檢驗(yàn)結(jié)果與對比方檢驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。且它的靈敏度更高（100拷貝是檢測限），價(jià)格更低廉，檢測的線性范圍（Ct值為12～40）更寬。