鹽脅迫條件下青楊和旱柳miRNA表達變化研究.pdf

1、土壤鹽漬化是當今全球性的資源環(huán)境問題和生態(tài)問題。世界上100多個國家大約有10億公頃的土地存在不同程度的鹽漬化，占全球陸地總面積10％。microRNA(miRNA)在植物非生物環(huán)境脅迫應答中的作用日益受到重視，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在抗逆調(diào)節(jié)中具有重要作用。miRNA是一類長約18-24個堿基的小分子非編碼單鏈RNA，它們廣泛存在于真核生物中。在植物中miRNA作為負調(diào)控因子，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達，從而影響植物器官的發(fā)生，發(fā)育和適應環(huán)

2、境的能力。
　　近年來，人們采用比較基因組學、構(gòu)建小RNA文庫等方法，發(fā)現(xiàn)植物miRNA。本研究通過構(gòu)建青楊小RNA文庫，同源序列比對和生物信息學分析及miRNA二級結(jié)構(gòu)分析，鑒定出5個候選miRNA，分別為ptc-miR801，ptc-miR74，ptc-miR102，ptc-miR367，ptc-miR213。這些miRNA通過定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和Northern blotting進行進一步分析，證明它們是青楊新

3、miRNA。另外，利用qRT-PCR技術(shù)驗證其在青楊中的空間表達情況，實驗證明，新miRNA在葉中的表達量遠遠高于莖和根。同時，利用生物信息學技術(shù)分析了這5個miRNA靶基因，發(fā)現(xiàn)ptc-miR801的靶基因NAC-domain protein，Scarecrow-like(SCL)和ptc-miR213的靶基因MYB4(v-mybavian myeloblastosis oncogene ortholog)都與鹽脅迫響應有關(guān)。進一步利

4、用qRT-PCR技術(shù)分析這兩個成熟miRNA在72h鹽脅迫(100mmol L-1NaCl)條件下的表達變化情況。結(jié)果顯示，ptc-miR801和ptc-miR213均上調(diào)表達。
　　基因芯片由于其具高通量，高靈敏性的特點，使得miRNA芯片非常適合檢測miRNA表達譜。利用miRNA芯片技術(shù)分別將對照組與100mmol L-1NaCl脅迫處理72小時的青楊(鹽敏感植物)和旱柳(耐鹽植物)miRNA表達變化情況進行分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫

5、后青楊中miRNA表達變化的有161個，其中ppt-miR477a-3p，ppt-miR477a-5p，ppt-miR477h等上調(diào)變化量的log值在兩倍以上。Ptc-miR474，ptc-miR160等下調(diào)變化量的log值在1倍以上。鹽脅迫后旱柳中miRNA表達變化有32個，其中ptc-miR474a，ppt-miR894，ptc-miR398b等上調(diào)變化量的log值在兩倍以上。Ptc-miR164f，ptc-miR1450等下調(diào)變化

6、量的log值在1倍以上。另外，利用qRT-PCR技術(shù)分別驗證了5個青楊miRNA和h4個旱柳miRNA及其它們對應的靶基因在鹽脅迫條件下的表達變化情況，實驗結(jié)果說明鹽敏感植物和耐鹽植物在miRNA表達模式上有所不同，miR398b和miR474c在青楊中下調(diào)表達，但在旱柳中它們均被上調(diào)表達。同時，分析了 miRNA與其靶基因在不同時間(0、3、6、9、12、48、72小時)的表達變化情況，結(jié)果都顯示出，在鹽敏感樹木與耐鹽樹木中，一些mi