鹽脅迫條件下水稻幼苗microRNA的克隆與研究初探.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類調(diào)控蛋白基因表達的小分子RNA，對于生物的生長發(fā)育具有重要的意義。要研究miRNA的具體結(jié)構和功能，首先要通過克隆方式獲得miRNA。目前植物miRNA的克隆主要是針對模式植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)，水稻(Oryza sativa)進行的。水稻是重要的糧食作物，其全基因組基因測序工作已經(jīng)完成，有利于對基因的結(jié)構域工作的分析。本實驗以水稻為主要實驗材料，在優(yōu)化植物R

2、NA提取技術的基礎上，進一步完善植物small RNA的提取和純化方法；然后在這些工作的基礎上克隆鹽脅迫水稻幼苗的miRNAs。結(jié)果如下： 1．針對不同的植物RNA提取具有不同要求的情況，以富含多糖多酚類物質(zhì)的麻瘋樹幼葉為材料，在現(xiàn)有植物 RNA提取方法的基礎上利用皂土對多糖多酚物質(zhì)具有吸附能力的特性，用之于植物RNA的提取。RNA電泳分析、純度鑒定及RT-PCR結(jié)果顯示：該種方法提取的RNA質(zhì)量好，純度高，能應用于后繼實驗。并

3、且與傳統(tǒng)RNA提取方法相比，該方法具有操作簡便，耗時短的特點，對富含多糖多酚類物質(zhì)的材料尤為有效。 2．以玉米(Zea mak,L.)幼苗為實驗材料，進行現(xiàn)有的RNA提取方法改進，以適應小分子RNA的提取。根據(jù)Mg<'2+>能有效沉淀小分子核酸的特性，使用Mg<'2+>代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Li<'+>，Na<'+>，NH<'4+>，K<'+>等沉淀離子進行沉淀，而且為了得到最佳實驗效果，對Mg<'2+>濃度、沉淀時間與溫度以及離心時間等

4、參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果顯示：最佳的分離small RNA的條件是：用100μm/ml MgCl<,2>加2.5倍體積的無水乙醇于-20℃沉淀2h，并在2℃，13000 rpm離心30 min。電泳分析及純度檢測結(jié)果顯示：在該條件下提取的RNA完整性好，純度高，1g新鮮玉米幼苗可以得到1.54μg small RNA，比參照方法高出約11％。并且操作簡單，耗時較少。 3．對水稻幼苗進行鹽脅迫，將其作為實驗材料進行miRNAs的克隆。在

5、克隆的過程中，首先對RNA的提取方法做了進一步的改進，除了用Mg<'2+>作為沉淀離子之外，在最終沉淀之前先使用了高鹽濃度下50％的PEG8000對smallRNAs進行富集，電泳及RNA純度分析顯示：該改進方法具有明顯的smallRNAs富集能力，并且所提取的RNAs純度高，質(zhì)量好。 4．將已經(jīng)提取的水稻RNA進行small RNAs的回收和純化，加Poly(A)、cDNA合成、加Poly(G)及PCR擴增；PCR擴增產(chǎn)物回收

6、后再與載體T-Vector連接，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。盡管重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低，未達到建立基因文庫的要求，但是菌落PCR能擴增出一定的預期片段，而且質(zhì)粒電泳結(jié)果也顯示部分轉(zhuǎn)化子有片段插入。雙酶切操作未能獲得預期片段，估計是由于預期片段太短，用瓊脂糖電泳不能有效檢測。因此，預期片段是否真正插入到轉(zhuǎn)化子中還有待進一步的檢測。 整個克隆鹽脅迫條件下水稻幼苗miRNAs的實驗雖然由于時間不足而沒有取得最終的結(jié)果，但是取得了階段性成功