Toll樣受體4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與支氣管哮喘免疫調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：1．觀察哮喘大鼠Toll樣受體4(TLR4)和P38MAPK表達(dá)的變化及其對(duì)EOS凋亡的作用；2．觀察不同濃度大腸埃希菌脂多糖(E．coliLPS)或DM對(duì)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)及哮喘氣道炎癥的調(diào)控作用；3．探討E．coliLPS或刪是否通過TLR4和TGF-β1介導(dǎo)外周誘導(dǎo)型CD4+CD25+Tr生成并表達(dá)FOXP3。 方法：1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：清潔級(jí)SD大鼠54只，隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、哮喘組(B組)、LPS組(分為C1組、C

2、2組、C3組)和DM組(D組)，每組9只。用卵白蛋白(OVA)致敏與激發(fā)建立大鼠哮喘模型。光鏡、電鏡觀察肺組織病理及超微結(jié)構(gòu)的變化，BALF中EOS及其他炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA法測(cè)定血清OVA-slgE含量及BALF中TGF．β1含量；原位雜交法測(cè)定肺組織TLR4mRNA表達(dá)；免疫組化法測(cè)定肺組織中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)，TUNEL法測(cè)定肺組織EOS凋亡情況。2．細(xì)胞培養(yǎng)：Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀及Dynal免疫磁珠法體

3、外分離培養(yǎng)健康人外周血CD4+CD25-T細(xì)胞，光鏡及電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)判斷細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)鑒定細(xì)胞純度；并設(shè)對(duì)照組(A組)、LPS組(B組)、DM組(C組)、LPS+TGF-β1單抗組(D)，各組設(shè)5孔，并在干預(yù)4h、ld、3d、5d后，F(xiàn)CM檢測(cè)CD4+CD25+Tr表達(dá)陽(yáng)性率變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液TGF-β1含量，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞TLR4mRNA及FOXP3mRNA表達(dá)。 結(jié)果

4、： 1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)： (1)光鏡觀察：B組見支氣管及血管周圍、肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管粘膜下水腫，粘液腺增生，粘膜皺折增多，部分粘膜上皮細(xì)胞脫落，可見氣道粘液栓；A組未見上述現(xiàn)象；C1組、C3組上述改變無明顯減輕；C2組、D組上述現(xiàn)象明顯減輕。(2)電鏡觀察：B組見EOS數(shù)量增多，周圍有大量漿細(xì)胞聚集，肺泡II型上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死，支氣管上皮纖毛排列稀疏、斷裂現(xiàn)象；A組EOS數(shù)量極少，肺泡II型上皮細(xì)胞正

5、常；C1組較B組無明顯改變；C2組凋亡的EOS增多；C3組中性粒細(xì)胞和凋亡的EOS均增多；D組上述現(xiàn)象明顯減輕。(3)BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)：B組BALF中細(xì)胞總數(shù)((4．29±0．12)×100／L)、EOS絕對(duì)計(jì)數(shù)((33．94±5．04)×107/L)和EOS占細(xì)胞總數(shù)的百分比(EOS％)((8．50±0．56)％)均高于A組(分別為(2．01±0．10)×109／L、(1．25±0．27)×107／L、(O．56±O．18)％)

6、(均P<0．01)；C2組(分別為(2．64±0．38)×10V／L、(8．56±1．99)×107／L、(3．17±0．25)％)和D組(分別為(2．14±O．10)×10V／L、(4．78±1．23)×107／L、(2．17±0．25)％)均低于B組(均P<0．01)。(4)血清OVA-slgE和BALF中TGF．B1含量：ELISA法檢測(cè)血清OVA—slgE結(jié)果，B組((83．40±6．80)ng/ml)高于A組((14．38±4

7、．25)ng／m1)(P<0．01)；C2組((48．68±7．98)ng／m1)、C3組((43．46±7．57)ng/m1)和D組((45．02±7．47)ng/m1)明顯低于B組(均P<0．01)；但C1組((87．08±6．99)ng/m1)與B組比較無顯著性差異(P>0．05)。ELISA法檢測(cè)BALF中TGF-β1結(jié)果，B組((1．47±0．15)ng/m1)與A組((1．26±0．11)ng/m1)比較，兩組有顯著性差異(

8、P<0．05)；C2組((1．93±0．20)ng/m1)、C3組((2．01±O．19)ng/m1)和D組((2．50±0．21)ng/m1)明顯高于B組(均P<0．01)。(5)肺組織TLR4mRNA和磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)：原位雜交檢測(cè)結(jié)果，TLR4mRNA主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及EOS；TLR4mRNA表達(dá)光密度(0D)值B組(25．81±3．56)與A組(24．71±0．85)

9、無顯著性差異(P>0．05)；C1組(29．86±3．92)、C2組(34．45±1．24)、C3組(39．47±1．24)及D組(33．94±3．28)表達(dá)均高于B組(均P<0．01)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果，磷酸化P38MAPK蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及EOS；磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)的OD值B組(25．53±1．40)與A組(12．06±1．34)比較有非常顯著性差異(P<0．01)；C1組(28．5

10、0±1．01)、C2組(36．55±1．48)、C3組(39．72±1．59)分別與B組比較有非常顯著性差異(P<0．01)；D組(27．31±2．56)與B組比較有顯著性差異(P<0．05)。(6)TUNEL檢測(cè)EOS凋亡率：肺組織EOS凋亡率B組((7．39±1．93)％)與A組((9．06±1．52)％)比較，兩組有顯著性差異(P<0．05)；C2組((12．78±0．91)％)、C3組((14．50±1．07)％)和D組((13

11、．33±1．09)％)與B組比較EOS凋亡率均明顯增高(均P0．05)。(7)相關(guān)分析：TLR4mRNA表達(dá)與磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)有非常顯著性正相關(guān)(r=0．845，P<0．01)；后者與EOS凋亡有非常顯著性正相關(guān)(r=0．522，P<0．01)；TLR4mRNA表達(dá)與BALF中TGF-β1水平有非常顯著性正相關(guān)(r=0．62l，P<0．01)；后者

12、與BALF中EOS數(shù)有非常顯著性負(fù)相關(guān)(r=．0．483，P<0．01)。 2．細(xì)胞培養(yǎng)： (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：光鏡下分離的CD4+CD25-T細(xì)胞主要為小體積實(shí)質(zhì)性細(xì)胞；電鏡下細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)致密，細(xì)胞質(zhì)很少。CD3／CD28單抗刺激培養(yǎng)及LPS或DM干預(yù)后，細(xì)胞體積逐漸增大，胞質(zhì)較豐富；電鏡下細(xì)胞核呈橢圓形或腎型，染色質(zhì)較稀疏，胞質(zhì)內(nèi)含許多游離核糖體。(2)細(xì)胞分離純度及活力測(cè)定：FCM檢測(cè)CD4+CD25'T

13、細(xì)胞分離的純度達(dá)91．5％-96％((93．30±1．75)％)；臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)測(cè)定分離前后的細(xì)胞懸液中細(xì)胞的活力分別為((93．20±1．15)％)和((94．90±1．78)％)，分離前后比較無顯著性差異(P>0．05)。p)CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性率檢測(cè)：FCM檢測(cè)LPS或DM干預(yù)5d時(shí)CD4+CD25+Tr表達(dá)陽(yáng)性率，B5d組((55．99±1．42)％)、C5d組((46．32±1．99)％)均高于A5d組((1．29

14、±0．04)％)(均P<0．01)；B5d組、C5d組分別與B4h組((1．40±0．08)％)、C4h組((1．18±0．05)％)比較均有非常顯著性差異(P<0．01)；D5d組((1．99±0．83)％)分別與A5d組((1．29±0．04)％)、D4h組((1．26±0．04)％)比較均無顯著性差異(均P>0．05)。(4)細(xì)胞上清液TGF-β1含量測(cè)定：ELISA檢測(cè)結(jié)果，B組或C組在5d時(shí)達(dá)高峰，B組(B4h組f1．83±0

15、．14)ng/ml、B1d組(1．83±O．14)ng/ml、B3d組(1．83±O．14)ng／ml、B5d組(1．83±O．14)ng／m1)或C組(C4h組(1．01±0．08)ng/ml、C1d組(1．19±0．07)ng/ml、C3d組(1．44±O．12)ng/ml、C5d組(1．78±0．11)ng/m1)分別與A組(A4h組(035±0．06)ng／ml、Ald組(036±0．42)ng/ml、A3d組(035±0．04

16、)ng/ml、A5d組(0．33±0．08)ng/m1)比較均有非常顯著性差異(均P<0．01)，且B1d組、B3d組、B5d組分別與B4h組比較有非常顯著性差異(均P<0．01)，Cld組、C3d組、C5d組分別與C4h組比較有非常顯著性差異(均P<0．01)；D組(D4h組(034±0．06)ng／ml、D1d組(039±0．05)ng／ml、D3d組(035±0．05)ng/ml、D5d組(O．28±0．05)ng/m1)分別與A

17、4h組、A1d組、A3d組、A5d組比較均無顯著性差異(均P>0．05)，且D1d組、D3d組、D5d組分別與D4h組比較亦無顯著性差異(均P>0．05)；Unstim組(0．26±O．10ng/m1)與A4h組、A1d組、A3d組、A5d組比較均無顯著性差異(均P>0．05)。 結(jié)論： 1．哮喘大鼠肺組織TLR4表達(dá)與正常組比較無明顯改變，磷酸化P38MAPK蛋白增高可能與氣道上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。 2．E．col

18、iLPS可濃度依賴上調(diào)TLR4表達(dá)，并可能降低OVA-slgE水平、增加TGF—β1生成，誘導(dǎo)EOS凋亡；但過高濃度E．coliLPS(100ug／ml)可能促使中性粒細(xì)胞增高。 3．E．coliLPS促使哮喘大鼠肺組織磷酸化P38MAPK蛋白進(jìn)一步增高，可能與EOS凋亡增高有關(guān)。 4．E．coliLPS誘導(dǎo)人CD4+CD25。T細(xì)胞TLR4mRNA和FOXP3mRNA的表達(dá)，促進(jìn)CD4+CD25+Tr生成，可能與TGF