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1、第一部分高脂喂養(yǎng)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的影響 目的:觀察高脂喂養(yǎng)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的影響,以期探討血脂異常在DR發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法:建立糖尿病大鼠模型,隨機(jī)分為四組:(A)非糖尿病大鼠+普通飼料喂養(yǎng)組;(B)非糖尿病大鼠+高脂飼料喂養(yǎng)組;(C)糖尿病大鼠+普通飼料喂養(yǎng)組;(D)糖尿病大鼠+高脂飼料喂養(yǎng)組。分別進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片、石蠟切片及透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。 結(jié)果:(1)視網(wǎng)膜血管鋪片:A
2、、B組未見異常改變,C組可見閉塞的無細(xì)胞毛細(xì)血管,周細(xì)胞數(shù)量減少,D組病變最為嚴(yán)重,可見多數(shù)閉塞的無細(xì)胞毛細(xì)血管及毛細(xì)血管無灌注區(qū),周細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。(2)HE染色切片:A、B組未見異常改變;C組可見視網(wǎng)膜增厚,尤其內(nèi)叢狀層和視桿、視錐細(xì)胞層;D組病變最明顯,細(xì)胞排列紊亂,內(nèi)核層血管周圍水腫,節(jié)細(xì)胞排列不規(guī)則,數(shù)目減少,靜脈擴(kuò)張、滲出,出血。(3)透射電鏡觀察:A、B組未見異常改變;C組可見內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞腫脹,毛細(xì)血管基底膜輕度增
3、厚;D組可見內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞核異染色質(zhì)濃集、居邊,線粒體腫脹變性,甚至呈空泡狀,管腔狹窄,視細(xì)胞外節(jié)盤膜結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)節(jié)線粒體腫脹。 結(jié)論:食餌性高脂血癥對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變病理改變的進(jìn)程有非常重要的作用,提示高脂血癥在DR的發(fā)生中起促進(jìn)作用。 第二部分脂質(zhì)和糖參與糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制的研究 第一章 LPC和糖對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞N0及NOS表達(dá)的影晌 目的:研究溶血磷脂酰膽堿(Lysophospha
4、tidylcholine,LPC)和糖對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Bovine retinal endothelial cell,BRECs)NO和NOS生成的影響,為進(jìn)一步闡明脂毒性在DR發(fā)生中的作用提供一定的實驗依據(jù)。 方法:應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基篩選細(xì)胞,差速黏附法純化BRECs。培養(yǎng)的BRECs分三組:第一組:加入不同濃度的LPC(0.60umol/L);第二組:加入不同濃度葡萄糖(5,6、30 mmol/L)和甘露醇(20mm
5、ol/L);第三組:加入LPC(60umol/L)和高糖(30 mmol/L)。用NO和NOS試劑盒檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量和NOS活性,RT-PCR法檢測eNOS mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果:①LPC(60umol/L)作用BRECs 24h后,與對照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)基中NO含量、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平較低(P<0.05);②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后,與對照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)
6、液中NO濃度、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平下降P<0.01),相同滲透壓的甘露醇對內(nèi)皮細(xì)胞NO濃度和NOS活性無影響(P>0.05);③LPC(60umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 24h后,與對照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量、NOS活性和細(xì)胞eNOSmRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論:LPC和高糖分別單獨作用能夠降低牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO和NOS的表達(dá)水平,且兩種因素有
7、協(xié)同作用,這可能是脂代謝紊亂參與DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。 第二章 LPO和糖對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B表達(dá)的影響 目的:研究LPC和糖對BRECs表達(dá)PDGF-B的影響,為進(jìn)一步闡明脂代謝紊亂在DR發(fā)生發(fā)展中的作用提供一定的實驗依據(jù)。 方法:原代培養(yǎng)的BRECs分三組:第一組:加入不同濃度的LPC(0.60umol/L);第二組:加入不同濃度葡萄糖(5.6、30mmogL)和甘露醇(20mmol/L);
8、第三組:加入LPC(60umol/L)和高糖(30 mmol/L)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PDGF-B蛋白的含量,RT-PCR法檢測PDGF-B mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果:①LPC(60umol/L)作用BRECs 12h后,與對照組比較,細(xì)胞培養(yǎng)液中PDGF-B含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平增加(p<0.01);②高糖(30mmol/L)作用BRECs 24h后,與對照組比較,細(xì)
9、胞培養(yǎng)液中PDGF-B含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平增加(P<0.05),相同滲透壓的甘露醇對內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B蛋白表達(dá)無影響(P>0.05);③LPC(60 umol/L)和葡萄糖(30mmol/L)共同作用BRECs 12h后,細(xì)胞培養(yǎng)液中PDGF-B的含量和細(xì)胞PDGF-BmRNA的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。 結(jié)論:LPC和高糖分別單獨作用能夠增加牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞PDGF-B的表達(dá)水平,且兩種因素
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