纖維粘連蛋白在腰椎間盤退變中的作用及其意義.pdf

1、下腰痛是脊柱外科的多發(fā)病。在成人喪失勞動(dòng)能力的原因中，下腰痛位居第三位，下腰痛的主要原因?yàn)樽甸g盤退變(intervertebraldiskdegeneration，IVDD)。鑒于此，弄清腰椎間盤退變的原因和機(jī)制顯得尤為重要。椎間盤退變致病因素的研究早期主要集中于對(duì)年齡和損傷等致病因素，自Hisao等發(fā)現(xiàn)椎間盤退變明顯的家族聚集性、Janne等發(fā)現(xiàn)Col2a1基因變異與椎間盤退變有明顯關(guān)系后，椎間盤退變的研究進(jìn)入發(fā)掘其特異性相關(guān)基因階段

2、。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與椎間盤退變相關(guān)的基因包括Sox9、Col9A2、Col9A3、Aggrecan等等。上述研究表明椎間盤退變和遺傳因素之間有著一定的聯(lián)系，因此對(duì)椎間盤退變相關(guān)基因及其基因治療的研究成為近幾年的研究熱點(diǎn)。在研究過程中發(fā)現(xiàn)不同人種的遺傳學(xué)因素并不相同，芬蘭人群中Trp2和Trp3位點(diǎn)突變與椎間盤病變的關(guān)系密切，而對(duì)于南歐洲人來說，Trp2和Trp3位點(diǎn)突變和椎間盤退變無關(guān)。漢族人和歐洲人人種差異來說，這樣的問題更加明顯。

3、因此，有必要對(duì)漢族人相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，從而為漢族人椎間盤退變的病因?qū)W提供準(zhǔn)確和詳細(xì)的數(shù)據(jù)。同時(shí)，當(dāng)確定和椎間盤退變相關(guān)的基因后，進(jìn)一步研究其相應(yīng)蛋白和椎間盤退變之間的關(guān)系，明確該基因在椎間盤退變中的確切作用，并對(duì)椎間盤退變的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討。 纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、核心蛋白、硫酸軟骨素、膠原、彈性蛋白等均為椎間盤內(nèi)含量較多的生物大分子，當(dāng)發(fā)生椎間盤退變后，它們的含量或存在形式會(huì)發(fā)生一定的變化，說明和椎間盤

4、退變存在一定的聯(lián)系，但它們的基因多態(tài)性和椎間盤退變是否存在一定的關(guān)系仍未可知。因此本試驗(yàn)對(duì)漢族人椎間盤退變和其中幾種生物大分子的基因多態(tài)性進(jìn)行研究，并探討其在椎間盤退變中的作用。 本試驗(yàn)對(duì)Fn和彈性蛋白的基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)結(jié)果，對(duì)Fn片段和椎間盤退變中的關(guān)系，以及椎間盤退變可能存在的機(jī)制進(jìn)行了研究和分析。根據(jù)以上目的本試驗(yàn)共分為以下四個(gè)部分。 第一部分：檢測(cè)Fn、彈性蛋白基因多態(tài)性和椎間盤退變的關(guān)系目的：檢測(cè)Fn

5、、彈性蛋白基因多態(tài)性與腰椎間盤退變的相互關(guān)系，提供漢族人腰椎間盤退變相關(guān)基因的確切數(shù)據(jù)。方法：收取腰椎間盤患者和正常人新鮮外周血標(biāo)本，患者和正常人腰椎間盤全部行MRI檢測(cè)，判定是否存在腰椎間盤退變。實(shí)驗(yàn)組共收集82例，對(duì)照組共收集117例。用DNA試劑盒抽提全血DNA。PCR法分別擴(kuò)增Fn和彈性蛋白相應(yīng)的目的基因片段。分別用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶作用于相應(yīng)片段的酶切位點(diǎn)。電泳顯示分析條帶。直接計(jì)數(shù)各基因型和等位基因數(shù)量，計(jì)算相應(yīng)頻率。結(jié)

6、果：Fn片段酶切位點(diǎn)酶切電泳后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：實(shí)驗(yàn)組中AA基因型者17例，AB基因型者50例，BB基因型者15例，其中等位基因A共84例，等位基因B共80例。對(duì)照組中AA型者22例，AB型者50例，BB型者45例，其中等位基因A共94例，B共140例?；蛐头治鼋Y(jié)果為X2=9.788，自由度=2，P=0.007＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等位基因分析結(jié)果為X2=4.761，自由度=1，P=0.029＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。彈性蛋白目的

7、片段酶切位點(diǎn)酶切電泳后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：試驗(yàn)組CC基因型者36例，CD基因型者22例，DD基因型者24例，其中等位基因C共94例，等位基因D共70例。對(duì)照組中CC型者53例，CD型者30例，DD型者34例，其中等位基因C共136例，D共98例?；蛐徒Y(jié)果為X2=0.048，自由度=2，P=0.976＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等位基因分析結(jié)果為X2=0.063，自由度=1，P=0.801＞0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：①Fn在MspⅠ酶切

8、位點(diǎn)處基因多態(tài)性與腰椎間盤退變之間存在相關(guān)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②彈性蛋白R(shí)saⅠ酶切位點(diǎn)處基因多態(tài)性與腰椎間盤退變之間沒有相關(guān)性，其間關(guān)系沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第二部分：120KDaFn-f對(duì)兔腰椎間盤的作用目的：研究120KDaFn-f對(duì)兔腰椎間盤的作用，觀察是否能夠引起兔腰椎間盤的退變。方法：取20只新西蘭大白兔觀察椎間盤解剖數(shù)據(jù)，檢測(cè)注射方法的成功率。取30只新西蘭大白兔，分成5組，以微量注射器于L4、6注入1μmol/L的1

9、20KDaFn-f25μL，于L5注入25μL無菌PBS液作為對(duì)照。分別于術(shù)后2、4、8、12、16周對(duì)椎間盤進(jìn)行X線、MRI、大體解剖和HE、Masson、高碘酸-Schiff染色組織病理學(xué)檢測(cè)，掃描電鏡透射電鏡檢測(cè)，觀察椎間盤的變化。①組織學(xué)觀察：取材，行椎間盤橫斷位切片，HE、Masson三色、高碘酸-Schiff染色進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。超微結(jié)構(gòu)使用電子顯微鏡觀察。②分子生物學(xué)檢測(cè)：取材，提取等質(zhì)量椎間盤標(biāo)本的總RNA。采用RT-

10、PCR方法分別擴(kuò)增目的基因片段。GAPDH做為內(nèi)參照進(jìn)行mRNA表達(dá)半定量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS9.0軟件包統(tǒng)計(jì)。③影像學(xué)檢測(cè)：各時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物麻醉后行X線片、MRI檢查，觀察椎間盤是否發(fā)生脫水退變。④免疫組化檢測(cè)：取材，行椎間盤橫斷位切片，制作石蠟切片，用IL-1β、MMP-13抗體行免疫組化DAB染色檢測(cè)。結(jié)果：①共注射70個(gè)椎間盤，成功注射64個(gè)，總體成功率為91.4％，單純L3～L6椎間盤注射成功率為97.2％。②組織學(xué)檢查：對(duì)照組

11、纖維環(huán)膠原排列整齊，試驗(yàn)組從第8周開始纖維環(huán)膠原發(fā)生玻璃樣變性，間隔變得模糊，纖維間出現(xiàn)裂隙。纖維環(huán)軟骨樣細(xì)胞開始向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。髓核細(xì)胞數(shù)量開始減少，第16周標(biāo)本中髓核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，趨于消失。同時(shí)第8周開始在纖維環(huán)外側(cè)出現(xiàn)瘢痕樣組織，并逐漸軟骨化、骨化。③分子生物學(xué)檢測(cè)：注射Fn片段的椎間盤隨著術(shù)后時(shí)間延長，aggrecanmRNA的相對(duì)表達(dá)量下降，對(duì)照組則沒有明顯變化。④影像學(xué)檢測(cè)：MRI觀察：試驗(yàn)組第4周開始出現(xiàn)髓核區(qū)高信號(hào)強(qiáng)

12、度下降，面積開始縮小。第16周髓核高信號(hào)區(qū)基本消失。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)無明顯不同。X線觀察：側(cè)位片上術(shù)后第12周注射120KDaFn實(shí)驗(yàn)組椎間盤后側(cè)開始出現(xiàn)骨樣組織，數(shù)量極少。術(shù)后第16周，骨樣組織數(shù)量增多，形成類骨贅樣物。⑤免疫組化檢測(cè)：注射Fn片段的椎間盤術(shù)后第2周開始出現(xiàn)IL-1β和MMP-13的表達(dá)，其中椎間盤各部分都能表達(dá)IL-1β，而MMP-13僅在髓核內(nèi)表達(dá)。結(jié)論：①注射方法準(zhǔn)確可靠，適合于進(jìn)行規(guī)范化實(shí)驗(yàn)研究。②120KDaF

13、n-f能夠誘導(dǎo)兔腰椎間盤退變的發(fā)生。③120KDaFn-f在誘導(dǎo)退變過程中可見纖維環(huán)和髓核產(chǎn)生大量IL-1β。④120KDaFn-f在誘導(dǎo)退變過程中可見髓核產(chǎn)生大量MMP-13，纖維環(huán)基本不產(chǎn)生MMP-13。 第三部分：120KDaFn-f對(duì)兔腰椎間盤細(xì)胞的作用目的：檢測(cè)120KDaFn-f是否能夠誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞自分泌炎癥因子和MMPs。方法：分離培養(yǎng)兔腰椎間盤各種細(xì)胞，鑒定后用120KDaFn-f進(jìn)行處理，對(duì)照組使用PBS。分

14、別用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)IL-1β和MMP-13行免疫熒光檢測(cè)；分別提取試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，半定量法分別檢測(cè)二者mRNA的表達(dá)。結(jié)果：試驗(yàn)組終板軟骨細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞均能產(chǎn)生IL-1β，RT-PCR可擴(kuò)增得到IL-1βmRNA的表達(dá)條帶；對(duì)照組則沒有相關(guān)表達(dá)。試驗(yàn)組終板軟骨細(xì)胞能夠產(chǎn)生MMP-13免疫熒光和相應(yīng)條帶，但是纖維環(huán)細(xì)胞則不能產(chǎn)生相應(yīng)結(jié)果。結(jié)論：①120KDaFn-f能夠直接對(duì)腰椎間盤細(xì)胞產(chǎn)

15、生作用。②120KDaFn-f能夠誘導(dǎo)椎間盤終板軟骨細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生IL-1β。③120KDaFn-f能夠誘導(dǎo)椎間盤軟骨終板細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生MMP-13。④120KDaFn-f誘導(dǎo)下椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞基本不表達(dá)MMP-13。 第四部分：FnEDA陽性片段在退變椎間盤中的表達(dá)目的：檢測(cè)退變椎間盤內(nèi)EDA+Fn的表達(dá)，探討損傷在椎間盤退變中的作用。方法：取自椎間盤突出癥患者手術(shù)摘除的標(biāo)本，共10例，均經(jīng)病理證實(shí)有腰椎間盤退行性變。

16、對(duì)照組3例椎間盤組織標(biāo)本，取自新鮮尸體，經(jīng)病理檢查未見退變表現(xiàn)。根據(jù)MRI對(duì)病例組椎間盤退變情況按Schneiderman's方法進(jìn)行分級(jí)，對(duì)照組均為1級(jí)；實(shí)驗(yàn)組2級(jí)4個(gè)標(biāo)本，3級(jí)3個(gè)標(biāo)本，4級(jí)者3個(gè)標(biāo)本。提取等質(zhì)量椎間盤標(biāo)本的總mRNA。采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因片段。GAPDH做為內(nèi)參照檢測(cè)mRNA表達(dá)半定量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS9.0軟件包統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：正常和退變椎間盤標(biāo)本均擴(kuò)增出EDA-片段(356bp)高亮度條帶，所有標(biāo)本均