纖維粘連蛋白在腰椎間盤退變中的作用及其意義.pdf

1、下腰痛是脊柱外科的多發(fā)病。在成人喪失勞動能力的原因中，下腰痛位居第三位，下腰痛的主要原因為椎間盤退變(intervertebraldiskdegeneration，IVDD)。鑒于此，弄清腰椎間盤退變的原因和機制顯得尤為重要。椎間盤退變致病因素的研究早期主要集中于對年齡和損傷等致病因素，自Hisao等發(fā)現(xiàn)椎間盤退變明顯的家族聚集性、Janne等發(fā)現(xiàn)Col2a1基因變異與椎間盤退變有明顯關(guān)系后，椎間盤退變的研究進入發(fā)掘其特異性相關(guān)基因階段

2、。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與椎間盤退變相關(guān)的基因包括Sox9、Col9A2、Col9A3、Aggrecan等等。上述研究表明椎間盤退變和遺傳因素之間有著一定的聯(lián)系，因此對椎間盤退變相關(guān)基因及其基因治療的研究成為近幾年的研究熱點。在研究過程中發(fā)現(xiàn)不同人種的遺傳學(xué)因素并不相同，芬蘭人群中Trp2和Trp3位點突變與椎間盤病變的關(guān)系密切，而對于南歐洲人來說，Trp2和Trp3位點突變和椎間盤退變無關(guān)。漢族人和歐洲人人種差異來說，這樣的問題更加明顯。

3、因此，有必要對漢族人相關(guān)基因進行檢測，從而為漢族人椎間盤退變的病因?qū)W提供準確和詳細的數(shù)據(jù)。同時，當(dāng)確定和椎間盤退變相關(guān)的基因后，進一步研究其相應(yīng)蛋白和椎間盤退變之間的關(guān)系，明確該基因在椎間盤退變中的確切作用，并對椎間盤退變的發(fā)生機制進行探討。 纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、核心蛋白、硫酸軟骨素、膠原、彈性蛋白等均為椎間盤內(nèi)含量較多的生物大分子，當(dāng)發(fā)生椎間盤退變后，它們的含量或存在形式會發(fā)生一定的變化，說明和椎間盤

4、退變存在一定的聯(lián)系，但它們的基因多態(tài)性和椎間盤退變是否存在一定的關(guān)系仍未可知。因此本試驗對漢族人椎間盤退變和其中幾種生物大分子的基因多態(tài)性進行研究，并探討其在椎間盤退變中的作用。 本試驗對Fn和彈性蛋白的基因多態(tài)性進行檢測，并根據(jù)結(jié)果，對Fn片段和椎間盤退變中的關(guān)系，以及椎間盤退變可能存在的機制進行了研究和分析。根據(jù)以上目的本試驗共分為以下四個部分。 第一部分：檢測Fn、彈性蛋白基因多態(tài)性和椎間盤退變的關(guān)系目的：檢測Fn

5、、彈性蛋白基因多態(tài)性與腰椎間盤退變的相互關(guān)系，提供漢族人腰椎間盤退變相關(guān)基因的確切數(shù)據(jù)。方法：收取腰椎間盤患者和正常人新鮮外周血標(biāo)本，患者和正常人腰椎間盤全部行MRI檢測，判定是否存在腰椎間盤退變。實驗組共收集82例，對照組共收集117例。用DNA試劑盒抽提全血DNA。PCR法分別擴增Fn和彈性蛋白相應(yīng)的目的基因片段。分別用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶作用于相應(yīng)片段的酶切位點。電泳顯示分析條帶。直接計數(shù)各基因型和等位基因數(shù)量，計算相應(yīng)頻率。結(jié)

6、果：Fn片段酶切位點酶切電泳后統(tǒng)計數(shù)據(jù)如下：實驗組中AA基因型者17例，AB基因型者50例，BB基因型者15例，其中等位基因A共84例，等位基因B共80例。對照組中AA型者22例，AB型者50例，BB型者45例，其中等位基因A共94例，B共140例。基因型分析結(jié)果為X2=9.788，自由度=2，P=0.007＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；等位基因分析結(jié)果為X2=4.761，自由度=1，P=0.029＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。彈性蛋白目的

7、片段酶切位點酶切電泳后統(tǒng)計數(shù)據(jù)如下：試驗組CC基因型者36例，CD基因型者22例，DD基因型者24例，其中等位基因C共94例，等位基因D共70例。對照組中CC型者53例，CD型者30例，DD型者34例，其中等位基因C共136例，D共98例?；蛐徒Y(jié)果為X2=0.048，自由度=2，P=0.976＞0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；等位基因分析結(jié)果為X2=0.063，自由度=1，P=0.801＞0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：①Fn在MspⅠ酶切

8、位點處基因多態(tài)性與腰椎間盤退變之間存在相關(guān)性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。②彈性蛋白RsaⅠ酶切位點處基因多態(tài)性與腰椎間盤退變之間沒有相關(guān)性，其間關(guān)系沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 第二部分：120KDaFn-f對兔腰椎間盤的作用目的：研究120KDaFn-f對兔腰椎間盤的作用，觀察是否能夠引起兔腰椎間盤的退變。方法：取20只新西蘭大白兔觀察椎間盤解剖數(shù)據(jù)，檢測注射方法的成功率。取30只新西蘭大白兔，分成5組，以微量注射器于L4、6注入1μmol/L的1

9、20KDaFn-f25μL，于L5注入25μL無菌PBS液作為對照。分別于術(shù)后2、4、8、12、16周對椎間盤進行X線、MRI、大體解剖和HE、Masson、高碘酸-Schiff染色組織病理學(xué)檢測，掃描電鏡透射電鏡檢測，觀察椎間盤的變化。①組織學(xué)觀察：取材，行椎間盤橫斷位切片，HE、Masson三色、高碘酸-Schiff染色進行光學(xué)顯微鏡觀察。超微結(jié)構(gòu)使用電子顯微鏡觀察。②分子生物學(xué)檢測：取材，提取等質(zhì)量椎間盤標(biāo)本的總RNA。采用RT-

10、PCR方法分別擴增目的基因片段。GAPDH做為內(nèi)參照進行mRNA表達半定量。實驗數(shù)據(jù)用SPSS9.0軟件包統(tǒng)計。③影像學(xué)檢測：各時間點將動物麻醉后行X線片、MRI檢查，觀察椎間盤是否發(fā)生脫水退變。④免疫組化檢測：取材，行椎間盤橫斷位切片，制作石蠟切片，用IL-1β、MMP-13抗體行免疫組化DAB染色檢測。結(jié)果：①共注射70個椎間盤，成功注射64個，總體成功率為91.4％，單純L3～L6椎間盤注射成功率為97.2％。②組織學(xué)檢查：對照組

11、纖維環(huán)膠原排列整齊，試驗組從第8周開始纖維環(huán)膠原發(fā)生玻璃樣變性，間隔變得模糊，纖維間出現(xiàn)裂隙。纖維環(huán)軟骨樣細胞開始向纖維細胞轉(zhuǎn)變。髓核細胞數(shù)量開始減少，第16周標(biāo)本中髓核細胞數(shù)量明顯減少，趨于消失。同時第8周開始在纖維環(huán)外側(cè)出現(xiàn)瘢痕樣組織，并逐漸軟骨化、骨化。③分子生物學(xué)檢測：注射Fn片段的椎間盤隨著術(shù)后時間延長，aggrecanmRNA的相對表達量下降，對照組則沒有明顯變化。④影像學(xué)檢測：MRI觀察：試驗組第4周開始出現(xiàn)髓核區(qū)高信號強

12、度下降，面積開始縮小。第16周髓核高信號區(qū)基本消失。對照組各時間點無明顯不同。X線觀察：側(cè)位片上術(shù)后第12周注射120KDaFn實驗組椎間盤后側(cè)開始出現(xiàn)骨樣組織，數(shù)量極少。術(shù)后第16周，骨樣組織數(shù)量增多，形成類骨贅樣物。⑤免疫組化檢測：注射Fn片段的椎間盤術(shù)后第2周開始出現(xiàn)IL-1β和MMP-13的表達，其中椎間盤各部分都能表達IL-1β，而MMP-13僅在髓核內(nèi)表達。結(jié)論：①注射方法準確可靠，適合于進行規(guī)范化實驗研究。②120KDaF

13、n-f能夠誘導(dǎo)兔腰椎間盤退變的發(fā)生。③120KDaFn-f在誘導(dǎo)退變過程中可見纖維環(huán)和髓核產(chǎn)生大量IL-1β。④120KDaFn-f在誘導(dǎo)退變過程中可見髓核產(chǎn)生大量MMP-13，纖維環(huán)基本不產(chǎn)生MMP-13。 第三部分：120KDaFn-f對兔腰椎間盤細胞的作用目的：檢測120KDaFn-f是否能夠誘導(dǎo)椎間盤細胞自分泌炎癥因子和MMPs。方法：分離培養(yǎng)兔腰椎間盤各種細胞，鑒定后用120KDaFn-f進行處理，對照組使用PBS。分

14、別用免疫細胞化學(xué)法對IL-1β和MMP-13行免疫熒光檢測；分別提取試驗組和對照組細胞總RNA，RT-PCR方法擴增目的基因片段，半定量法分別檢測二者mRNA的表達。結(jié)果：試驗組終板軟骨細胞和纖維環(huán)細胞均能產(chǎn)生IL-1β，RT-PCR可擴增得到IL-1βmRNA的表達條帶；對照組則沒有相關(guān)表達。試驗組終板軟骨細胞能夠產(chǎn)生MMP-13免疫熒光和相應(yīng)條帶，但是纖維環(huán)細胞則不能產(chǎn)生相應(yīng)結(jié)果。結(jié)論：①120KDaFn-f能夠直接對腰椎間盤細胞產(chǎn)

15、生作用。②120KDaFn-f能夠誘導(dǎo)椎間盤終板軟骨細胞和纖維環(huán)細胞表達產(chǎn)生IL-1β。③120KDaFn-f能夠誘導(dǎo)椎間盤軟骨終板細胞表達產(chǎn)生MMP-13。④120KDaFn-f誘導(dǎo)下椎間盤纖維環(huán)細胞基本不表達MMP-13。 第四部分：FnEDA陽性片段在退變椎間盤中的表達目的：檢測退變椎間盤內(nèi)EDA+Fn的表達，探討損傷在椎間盤退變中的作用。方法：取自椎間盤突出癥患者手術(shù)摘除的標(biāo)本，共10例，均經(jīng)病理證實有腰椎間盤退行性變。

16、對照組3例椎間盤組織標(biāo)本，取自新鮮尸體，經(jīng)病理檢查未見退變表現(xiàn)。根據(jù)MRI對病例組椎間盤退變情況按Schneiderman's方法進行分級，對照組均為1級；實驗組2級4個標(biāo)本，3級3個標(biāo)本，4級者3個標(biāo)本。提取等質(zhì)量椎間盤標(biāo)本的總mRNA。采用RT-PCR方法擴增目的基因片段。GAPDH做為內(nèi)參照檢測mRNA表達半定量。實驗數(shù)據(jù)用SPSS9.0軟件包統(tǒng)計。結(jié)果：正常和退變椎間盤標(biāo)本均擴增出EDA-片段(356bp)高亮度條帶，所有標(biāo)本均