碳酸酐酶12在腰椎間盤髓核退變中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 新型椎間盤髓核標志物在退變髓核中的表達和評估
　　目的:評估包括碳酸酐酶12(CA12)在內(nèi)的新髓核標志物在腰椎退行性疾病病人髓核組織中的標志作用。
　　方法:我們從脊柱手術(shù)病人中收集了81例髓核標本，分成退變組和對照組。每個標本都以腰椎磁共振、HE染色和番紅O染色評估退變程度，并以qPCR檢測aggrecan、II型膠原和SOX9的表達水平。所有標本均以qPCR方法檢測C

2、A12及其他12個新椎間盤髓核標記物的表達水平。以免疫組織化學和Western Blot檢測組織中CA12的表達水平。
　　結(jié)果:在退變組中，CA12及其他11個新髓核標記物表達顯著低于對照組，且為椎間盤退變的危險因素，以CA12等單因素分析的B值最小。此外，CA12在蛋白水平上也有顯著差異表達。
　　結(jié)論:CA12等12個新髓核標記物在退變髓核中有差異表達，可以作為髓核退變標記物。
　　第二部分 CA12在椎間盤退變

3、中的作用及其調(diào)控機制
　　目的:闡明CA12在椎間盤髓核代謝中的作用及其上游調(diào)控機制。
　　方法:為探索CA12在髓核細胞中的具體功能，我們以CA12 siRNA處理大鼠髓核細胞，并檢測合成代謝和分解代謝相關(guān)指標，同時，我們在CA12 siRNA處理并上調(diào)pH時檢測合成代謝和分解代謝相關(guān)指標。我們以實時定量PCR檢測了81例人退變或正常髓核標本中的缺氧誘導因子1α(HIF-1α)和HIF-2α的表達。我們在低氧條件下培養(yǎng)大鼠

4、髓核細胞，并檢測低氧誘導CA12的表達。為驗證脯氨酸脫氫酶(PHD)/HIF-1對CA12表達的調(diào)控，我們以HIF-1α siRNA和PHD抑制劑DMOG處理大鼠髓核細胞，并檢測CA12表達水平。
　　結(jié)果:在低氧環(huán)境下，CA12表達可以增加約30倍。HIF-1α，而不是HIF-2α的表達水平也在退變髓核中下降，并與CA12表達成正相關(guān)。HIF-1α水平敲低能夠?qū)е翪A12水平下降，而DMOG處理后CA12的表達水平升高。CA12

5、敲低可以顯著抑制合成代謝相關(guān)分子表達，而分解代謝分子保持不變。而上調(diào)pH后Ⅱ型膠原和SOX9也可以上調(diào)。
　　結(jié)論:CA12的表達受PHD/HIF-1軸調(diào)控。CA12可能可以通過調(diào)節(jié)pH影響髓核合成代謝，在椎間盤退行性疾病中起重要作用。
　　第三部分 器官培養(yǎng)模型中驗證PHD/HIF-1/CA12對椎間盤退變的作用
　　目的:進一步驗證PHD/HIF-1對CA12的調(diào)控作用及對椎間盤退變的作用。
　　方法:建立全

6、椎間盤培養(yǎng)模型，以DMOG和/或碳酸酐酶抑制劑ACTZ處理全椎間盤培養(yǎng)模型，以HE染色和番紅O染色從組織學水平驗證退變程度，以qPCR檢測aggrecan、Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原、SOX9、CA12和HIF-1α的mRNA水平的表達，以Western Blot檢測CA12和HIF-1α蛋白水平的表達。
　　結(jié)果:與對照組比較，DMOG處理組的髓核基質(zhì)明顯增多，aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX9的表達也顯著增多，而DMOG+ACTZ處