IGF-1在退變腰椎間盤(pán)髓核中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，realtime Q-PCR）方法，檢測(cè)不同退變程度的腰椎間盤(pán)髓核中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）mRNA定量表達(dá)情況，探討IGF－1的表達(dá)量與髓核退變程度的關(guān)系。 方法：收集大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院、大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院和北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部三院腰椎手術(shù)

2、后患者（年齡介于40-50歲之間）的髓核，將其按Pfirrmann分級(jí)分為輕度退變組（mild degeneration group，MID）、中度退變組（moderate degeneration group，MOD）和重度退變組（severe degeneration group，SED）。另取16-21歲之間爆裂骨折病人的髓核作為正常對(duì)照組（control group，CON）。將所有剛?cè)〕龅乃韬朔謩e用生理鹽水沖洗干凈，徹底清除纖

3、維環(huán)，剪成1*1*1mm大小迅速置于液氮中，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中備用。分別稱(chēng)取50mg椎間盤(pán)髓核組織，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280的比值，計(jì)算出各組的RNA的濃度，并用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)和隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA的完整性。選取IGF-1基因的第二外顯子（exon2）

4、區(qū)域cDNA，設(shè)計(jì)基因特異性引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行體外擴(kuò)增，并以18S作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化，統(tǒng)計(jì)并分析各組樣本在相同標(biāo)化條件下起始模板cDNA是否存在差異，并由此分析各組樣本的IGF-1基因表達(dá)的mRNA是否存在差異。 結(jié)果：（1）正常對(duì)照組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．856±0．073，輕度退變組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．870±0．080，中度退變組髓核總RNA的OD260/O

5、D280比值為1．886±0．085，重度退變組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．859±0．080。所有標(biāo)本總RNA的OD260/OD280比值均滿(mǎn)足要求。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組之間的OD260/OD280比值沒(méi)有明顯差異（P>0．05），說(shuō)明相同的質(zhì)量的髓核提取的總RNA也是相等的，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。（2）1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5S、18S、28S三條帶型整齊，無(wú)明顯拖尾及彌散，說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)完整

6、，無(wú)明顯降解。（3）逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增均有IGF-1基因和內(nèi)參對(duì)照18S基因的cDNA，與DNA分子Marker相比擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為187bp和151bp左右，與預(yù)定理論值大小符合。（4）IGF-1基因mRNA在不同退變程度的髓核中定量表達(dá)的情況經(jīng)過(guò)SPSS10．0 for Windows單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，除重度退變組與正常組無(wú)明顯差異（P>0．05）外，其余各組間均有明顯差異（P<0．01）。