IGF-1在退變腰椎間盤髓核中的表達及意義.pdf

1、目的：應用實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，realtime Q-PCR）方法，檢測不同退變程度的腰椎間盤髓核中胰島素樣生長因子1（IGF-1）mRNA定量表達情況，探討IGF－1的表達量與髓核退變程度的關系。 方法：收集大連大學附屬中山醫(yī)院、大連醫(yī)科大學附屬二院和北京大學醫(yī)學部三院腰椎手術

2、后患者（年齡介于40-50歲之間）的髓核，將其按Pfirrmann分級分為輕度退變組（mild degeneration group，MID）、中度退變組（moderate degeneration group，MOD）和重度退變組（severe degeneration group，SED）。另取16-21歲之間爆裂骨折病人的髓核作為正常對照組（control group，CON）。將所有剛取出的髓核分別用生理鹽水沖洗干凈，徹底清除纖

3、維環(huán)，剪成1*1*1mm大小迅速置于液氮中，轉入-80℃冰箱中備用。分別稱取50mg椎間盤髓核組織，采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定OD260/OD280的比值，計算出各組的RNA的濃度，并用1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。利用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術和隨機引物將總RNA逆轉錄成cDNA，并用2％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的完整性。選取IGF-1基因的第二外顯子（exon2）

4、區(qū)域cDNA，設計基因特異性引物在實時熒光定量PCR儀上進行體外擴增，并以18S作為內(nèi)參照進行標化，統(tǒng)計并分析各組樣本在相同標化條件下起始模板cDNA是否存在差異，并由此分析各組樣本的IGF-1基因表達的mRNA是否存在差異。 結果：（1）正常對照組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．856±0．073，輕度退變組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．870±0．080，中度退變組髓核總RNA的OD260/O

5、D280比值為1．886±0．085，重度退變組髓核總RNA的OD260/OD280比值為1．859±0．080。所有標本總RNA的OD260/OD280比值均滿足要求。經(jīng)統(tǒng)計學分析，各組之間的OD260/OD280比值沒有明顯差異（P>0．05），說明相同的質量的髓核提取的總RNA也是相等的，為進一步實驗奠定了基礎。（2）1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5S、18S、28S三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結構完整

6、，無明顯降解。（3）逆轉錄PCR擴增均有IGF-1基因和內(nèi)參對照18S基因的cDNA，與DNA分子Marker相比擴增產(chǎn)物大小分別為187bp和151bp左右，與預定理論值大小符合。（4）IGF-1基因mRNA在不同退變程度的髓核中定量表達的情況經(jīng)過SPSS10．0 for Windows單因素方差分析和LSD-t檢驗，統(tǒng)計分析結果顯示，除重度退變組與正常組無明顯差異（P>0．05）外，其余各組間均有明顯差異（P<0．01）。