泡盛曲霉植酸酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、本論文的研究目的是純化泡盛曲霉植酸酶蛋白，研究其酶學性質(zhì)，并克隆泡盛曲霉植酸酶基因，構(gòu)建植物表達載體并轉(zhuǎn)化模式植物煙草，分析比較煙草中重組植酸酶的酶學性質(zhì)。 本研究以半固體發(fā)酵方式培養(yǎng)泡盛曲霉(Aspergillusawamori)生產(chǎn)植酸酶，通過超濾、陰離子交換層析，凝膠層析等步驟，純化了植酸酶蛋白，分子量約為118kDa。脫糖基化結(jié)果顯示，該酶糖基化程度為40.6﹪。酶學性質(zhì)研究結(jié)果為：泡盛曲霉植酸酶反應最適溫度為55℃，最

2、適pH為5.5，37℃條件下以植酸鈉為底物的Km值為1.03nM，Vmax為2.13μM/min。金屬離子對酶活性影響的研究結(jié)果表明，EDTA基本不影響植酸酶活性，Ca2+，Mg2+，Mn2+有輕微的抑制作用，F(xiàn)e2+，Zn2+抑制作用顯著。對該酶的耐熱性研究表明，在較高溫度條件處理后，仍有較高殘余酶活性，與當今商品化的植酸酶相比，有較強的耐熱性。 利用PCR技術(shù)克隆了泡盛曲霉植酸酶基因及其編碼區(qū)全序列，構(gòu)建了植物表達載體pBI

3、121-SP/phy，凍融法將質(zhì)粒導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程菌LBA4404-pBI121-SP/phy。 葉盤法將植酸酶基因?qū)肓四Ｊ街参餆煵荩@得卡那霉素抗性植株，通過PCR，SouthernBlotting證明外源植酸酶基因已成功導入煙草，對煙草葉片的植酸酶活性檢測證明重組植酸酶基因在煙草中能得到表達并積累。 初步純化了煙草葉片中的植酸酶蛋白，研究了其酶學性質(zhì)，反應最適溫度與最適pH與泡盛曲霉植酸酶的性