植酸酶基因定點(diǎn)突變的研究.pdf

1、定點(diǎn)誘變(site directed mutagenesis，SDM)技術(shù)是近年來生物工程研究中發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。通過定點(diǎn)誘變可以在體外改造目的DNA分子，進(jìn)而研究基因的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。定點(diǎn)誘變技術(shù)可以分為PCR介導(dǎo)的和非PCR介導(dǎo)的，由于近年來PCR的迅速發(fā)展，其PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法應(yīng)用也越來越廣泛，尤其是其中的大引物定點(diǎn)突變方法由于其自身的優(yōu)點(diǎn)在定點(diǎn)突變方法中具非常重要的地位。但其大引物方法本身也存在一些

2、不足：膠分離純化大引物過程費(fèi)時(shí)費(fèi)事，并且全長擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)率均較低。
　　 本試驗(yàn)對傳統(tǒng)的大引物突變方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過采用不對稱擴(kuò)增來消除其多余引物和加入酶DpnI消除野生模版對突變效率的影響并且省去了過程中的凝膠純化，簡化了步驟，節(jié)省了時(shí)間，其突變效率達(dá)到85％。此種方法在應(yīng)用于植酸酶的定點(diǎn)突變的研究中時(shí)，取得了很好的突變效果。
　　 植酸酶是催化植酸及其鹽類水解成低磷酸化的肌醇和磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱。在飼料

3、中添加植酸酶不但可以提高動(dòng)物對磷的吸收，降低環(huán)境中磷的污染，而且能解除植酸對金屬離子、氨基酸的螯合作用，大大提高飼料的利用效率，在國內(nèi)外飼料工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。由于黑曲霉來源地植酸酶的最適pH值為5.0，而單胃動(dòng)物腸道中的pH為3.5左右，因此本試驗(yàn)想通過定點(diǎn)突變方法使其適應(yīng)腸道中的低pH環(huán)境，使其更好的應(yīng)用于生產(chǎn)。本試驗(yàn)采取改進(jìn)的大引物方法，對Q278，K281兩點(diǎn)進(jìn)行突變并將突變的基因轉(zhuǎn)入到真核宿主中進(jìn)行表達(dá)。通過與酵母工程菌

4、GA-22的所產(chǎn)植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的對比分析，GA-22在pH3.0和pH5.0處各有一個(gè)酶活峰，突變菌株EE-1（K281E）的酶活為81696U/mL，提高了酶活的20％，最適pH值為5.0，僅有一個(gè)酶活峰。突變菌株EE-2(K281EQ278L)的酶活力為62376U/mL，最適pH值為5.5，僅有一個(gè)酶活峰，在對其熱穩(wěn)定性的研究中時(shí)發(fā)現(xiàn)在60℃和80℃處理30min后的突變菌株EE-1的相對殘余酶活分別為86.6％,79.8％，在6