旋毛蟲Nudix水解酶的克隆表達(dá)與功能鑒定.pdf

1、自1835年旋毛蟲被發(fā)現(xiàn)以來尚無有效的預(yù)防疫苗。旋毛蟲幼蟲囊包經(jīng)口感染宿主后，在胃液的作用下幼蟲自囊包內(nèi)逸出，在膽汁作用下發(fā)育為腸道感染性幼蟲，然后侵入腸黏膜經(jīng)4次蛻皮發(fā)育為成蟲。因此，旋毛蟲幼蟲侵入腸黏膜繼續(xù)發(fā)育是旋毛蟲感染宿主的關(guān)鍵步驟，但旋毛蟲侵入腸黏膜的機制尚不完全清楚。由于旋毛蟲口孔無齒狀及矛狀結(jié)構(gòu)，幼蟲侵入腸上皮細(xì)胞（IECs）不是簡單的機械性侵入，很可能與幼蟲表面或者口孔分泌的一些蛋白有關(guān)，這些蛋白可能與IECs相互作用而

2、促進(jìn)了幼蟲的侵入。
　　我們課題組前期應(yīng)用Western blot與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析感染性幼蟲與IECs共孵育后蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)有64種旋毛蟲蛋白進(jìn)入了IECs內(nèi)，其中部分蛋白具有水解酶（如Nudix水解酶）活性；隨后，又從旋毛蟲腸道感染性幼蟲T7噬菌體展示文庫與感染性幼蟲消減cDNA文庫篩選到4個表達(dá)上調(diào)且能與IECs結(jié)合的旋毛蟲基因，其中1個為旋毛蟲Nudix水解酶（TsNd）基因。Nudix超家族主

3、要是由焦磷酸水解酶組成，催化的底物是一類與核苷二磷酸相連的殘基X化合物（NDP-X）；一些Nudix超家族成員具有降解潛在突變和降解氧化核苷酸的能力，而其他超家族成員可控制新陳代謝中間物和信號復(fù)合物的合成水平。我們課題組的研究發(fā)現(xiàn)，T7噬菌體展示的TsNd多肽可與小鼠IECs結(jié)合，免疫小鼠后可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)作用；應(yīng)用RNAi干擾旋毛蟲TsNd基因后，幼蟲對IECs的侵入率明顯下降；將TsNd DNA疫苗免疫小鼠后，可產(chǎn)生抗旋毛蟲感染

4、的部分免疫保護(hù)作用；提示TsNd可能在旋毛蟲侵入IECs過程中具有重要作用，但關(guān)于TsNd的生物學(xué)特性、功能、與宿主的相互作用及其機制均不清楚。
　　本課題克隆表達(dá)了TsNd，應(yīng)用體內(nèi)外實驗對TsNd的生物學(xué)特性與功能進(jìn)行了分析；應(yīng)用ELISA的方法評價重組TsNd（rTsNd）對旋毛蟲病血清學(xué)診斷的價值；使用右旋葡萄糖硫酸鈉（DSS）腸炎模型觀察了rTsNd對化學(xué)性誘導(dǎo)腸炎的免疫預(yù)防效果及其機制。本課題對于闡明TsNd與宿主IE

5、Cs相互作用的機制具有重要的科學(xué)意義，并可為研制高保護(hù)性效果的旋毛蟲病疫苗及旋毛蟲蛋白抗炎新藥等奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.實驗小鼠、旋毛蟲、質(zhì)粒和菌株及細(xì)胞
　　本研究使用的小鼠包括BALB/c小鼠、昆明小鼠及C57BL/6小鼠；旋毛蟲包括旋毛蟲（T1，ISS534），鄉(xiāng)土旋毛蟲（T2，ISS10）、布氏旋毛蟲（T3，ISS100）、偽旋毛蟲（T4，ISS13）及納氏旋毛蟲（T7，ISS29）?？寺『捅磉_(dá)菌

6、分別為大腸埃希菌JM109和BL21(DE3)；克隆載體為pGEM-T，表達(dá)質(zhì)粒為pMAL-c2X。小鼠小腸上皮細(xì)胞（IECs）為本課題組前期分離得到，小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）、乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK）、小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7及小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞（WT macrophage）均由其他實驗室惠贈。
　　2. TsNd的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)與鑒定
　　應(yīng)用ORF Finder、ExPASy服務(wù)器、ProtScale

7、程序、TMHMM Server v.2.0、DNAstar Protean軟件等生物信息分析軟件對TsNd的生物學(xué)信息進(jìn)行分析；然后對TsNd基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，用Western blot分析rTsNd的抗原性及免疫原性；將純化的rTsNd免疫小鼠，制備抗rTsNd血清，分析其免疫應(yīng)答類型及抗旋毛蟲攻擊感染的免疫保護(hù)作用。
　　3. TsNd的生物學(xué)特性及功能分析
　　用qPCR及間接免疫熒光實驗（IFT）對TsNd的

8、轉(zhuǎn)錄水平、表達(dá)時相及在蟲體組織的定位進(jìn)行分析；應(yīng)用Ames和Dubin的方法及高效液相色譜（HPLC）對rTsNd的酶活性進(jìn)行分析；應(yīng)用旋毛蟲體外侵入IECs模型，對旋毛蟲侵入不同細(xì)胞的敏感性、rTsNd與抗rTsNd血清對旋毛蟲幼蟲侵入IECs的促進(jìn)或抑制作用進(jìn)行分析；應(yīng)用Far Western、IFT及激光共聚焦顯微鏡對 rTsNd與IECs的相互作用進(jìn)行分析。通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）實驗觀察抗rTsNd抗體

9、對旋毛蟲幼蟲的毒性作用。
　　4. rTsNd用于旋毛蟲病診斷
　　應(yīng)用肌幼蟲排泄分泌（ES）抗原與rTsNd分別建立檢測旋毛蟲抗體IgG的ES-ELISA與rTsNd-ELISA方法，檢測不同旋毛蟲、其他蟲種及不同時間旋毛蟲感染小鼠后血清抗體水平，分析rTsNd-ELISA診斷旋毛蟲病的敏感性與特異性。觀察rTsNd-ELISA對旋毛蟲早期感染的診斷效果。
　　5. rTsNd對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫治療效果及其機制

10、
　　將rTsNd腹腔免疫小鼠（以PBS腹腔注射為對照組），然后用2.5％DSS誘導(dǎo)2組小鼠化學(xué)性結(jié)腸炎，每天觀察小鼠的身體狀況并記錄其體重，誘導(dǎo)后第10天將小鼠用CO2處死，收集小鼠血清、結(jié)腸，分離脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞；根據(jù)小鼠體重及結(jié)腸炎癥變化分析rTsNd免疫后對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫預(yù)防效果；通過檢測小鼠血清抗體（IgG1、IgG2a及IgE）、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平及rTsNd在體外對脂多糖（LP

11、S）刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子的影響，分析rTsNd對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的可能作用機制。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理
　　使用SPSS17.0及Graphpad Prism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，rTsNd抗原檢測旋毛蟲抗體敏感性和特異性及旋毛蟲感染后不同時期抗體水平使用卡方檢驗和重復(fù)測量方差分析，其他多組間的比較使用方差分析，兩組之間的比較使用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1．T

12、sNd的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)與鑒定
　　TsNd基因序列分析顯示，TsNd基因開放閱讀框架（ORF）為堿基全長的第111到1358位，總長1248bp，編碼415個氨基酸，蛋白分子量大小為46 kDa,等電點為8.85，含有一個跨膜螺旋區(qū)，無信號肽，具有良好的抗原性，有兩個保守區(qū)，分別是Nudix模體和YhfT, Nudix模體為Nudix水解酶的活性位點和金屬結(jié)合位點。
　　利用克隆表達(dá)技術(shù)，成功構(gòu)建了pMAL-c2X

13、-TsNd重組表達(dá)質(zhì)粒，測序結(jié)果表明本研究克隆的TsNd與Genbank中TsNd的序列一致性為99.3%；序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示TsNd與偽旋毛蟲Nudix水解酶的相似性最高、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系最近。重組質(zhì)粒能在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)出可溶性的rTsNd。SDS-PAGE結(jié)果表明rTsNd的分子量為89kDa（46 kDa+43 kDa MBP tag）,與預(yù)測的rTsNd的分子量一致。Western blot分析發(fā)現(xiàn)rTs

14、Nd可被旋毛蟲感染小鼠血清、rTsNd免疫小鼠血清所識別；rTsNd免疫小鼠血清可識別旋毛蟲腸道感染性幼蟲、肌幼蟲、成蟲和新生幼蟲粗抗原及肌幼蟲ES抗原中的天然TsNd蛋白。將rTsNd免疫小鼠3次后ELISA檢測小鼠抗rTsNd抗體滴度為1:106，血清抗rTsNd IgG1明顯高于IgG2a，表明rTsNd免疫小鼠后產(chǎn)生了Th2型為主的免疫應(yīng)答。對免疫小鼠用300條旋毛蟲幼蟲攻擊感染后3d與35d，腸道成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為57.

15、70%和56.9%，表明rTsNd免疫小鼠后對旋毛蟲感染可產(chǎn)生部分免疫保護(hù)作用。
　　2. TsNd的生物學(xué)特性與功能
　　通過PCR和IFT分析發(fā)現(xiàn)TsNd基因在旋毛蟲不同發(fā)育期（肌幼蟲、腸道感染性幼蟲、成蟲、胚胎、新生幼蟲）均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并且在感染性幼蟲的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平較高；肌幼蟲蟲體石蠟切片IFT顯示，TsNd主要定位于蟲體的表皮、生殖原基及生殖器官部位。酶活性實驗結(jié)果顯示rTsNd具有天然的Nudix水解酶活性，能

16、對dGTP, NAD, NADP和CoA產(chǎn)生水解作用，并對dGTP的水解作用最強。經(jīng)HPLC分析，rTsNd對dGTP水解作用的最適條件為37℃、pH8.0及有Zn2+存在。旋毛蟲對不同細(xì)胞侵入的敏感性研究顯示，旋毛蟲幼蟲對IECs的侵入率最高（31.55%），C2C12與BHK細(xì)胞對旋毛蟲幼蟲的侵入不敏感，表明旋毛蟲對細(xì)胞的侵入具有特異性與選擇性。IFT結(jié)果表明， rTsNd能夠與IECs及小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，但不能與C2C12細(xì)

17、胞、BHK細(xì)胞及肺組織結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)rTsNd可特異性的結(jié)合在IECs細(xì)胞膜上；Far Western分析顯示rTsNd可與IECs的10個蛋白條帶結(jié)合，提示rTsNd能夠與IECs中的蛋白產(chǎn)生相互作用。體外侵入實驗發(fā)現(xiàn)rTsNd對旋毛蟲幼蟲侵入IECs具有促進(jìn)作用，抗rTsNd血清組幼蟲對IECs的侵入率明顯低于正常血清組（9.83%vs33.96%；χ2=18.15, P<0.01），且抗rTsNd血清對幼蟲侵入IECs

18、的抑制作用具有抗體劑量依賴性。ADCC實驗結(jié)果顯示，抗rTsNd血清與正常血清組肌幼蟲死亡率分別為76.16%和22.75%，腸道感染性幼蟲的死亡率分別為66.84%和9.92%，兩組血清幼蟲的死亡率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明抗rTsNd抗體參與了ADCC過程，可能與rTsNd免疫小鼠后產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用有關(guān)。
　　3．rTsNd對旋毛蟲病血清學(xué)診斷的潛在價值
　　應(yīng)用rTsNd-ELISA檢測旋毛蟲感染小鼠不

19、同時間血清抗體，結(jié)果顯示：rTsNd及旋毛蟲肌幼蟲ES抗原對旋毛蟲感染小鼠血清的敏感性均為100%（30/30），特異性分別為100%(54/54)和98%(53/54),兩種抗原特異性的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；rTsNd抗原與弓形蟲、裂頭蚴感染小鼠血清和正常小鼠血清無交叉反應(yīng)。rTsNd對不同種旋毛蟲感染小鼠的特異性的檢測結(jié)果顯示：rTsNd和ES抗原在檢測T2、T3和T7感染小鼠血清抗體陽性率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0

20、5）,而檢測T4感染小鼠血清抗體的陽性率分別為63.64%和90.91%（P<0.05），提示TsNd可能在成囊型旋毛蟲（T1、T2、T3和T7）具有較高的表達(dá)并能被其抗血清識別，但在非成囊型旋毛蟲（T4）的表達(dá)水平較低。rTsNd-ELISA和ES-ELISA對旋毛蟲感染小鼠的早期血清檢測結(jié)果表明，ES抗原最早檢測出抗體陽性的時間為感染后10d，而rTsNd為感染后14d。
　　4．rTsNd對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫治療效果及其

21、機制
　　PBS對照組小鼠在DSS處理后第4天出現(xiàn)腸炎跡象，第5天出現(xiàn)體重下降；而rTsNd免疫小鼠的腸炎體征不明顯，其體重也得到較好的控制。誘導(dǎo)腸炎第10天，解剖小鼠發(fā)現(xiàn)PBS對照組小鼠的結(jié)腸明顯變薄、變短，結(jié)腸切片H&E染色發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中出現(xiàn)了大量的炎癥細(xì)胞浸潤、潰瘍、水腫、杯狀細(xì)胞的喪失及正常腸結(jié)構(gòu)的破壞，而rTsNd免疫組小鼠則未出現(xiàn)這種典型的炎癥表現(xiàn)。結(jié)腸冰凍切片IFT結(jié)果顯示，rTsNd免疫小鼠能夠抑制結(jié)腸炎性組織中中

22、性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的浸潤。rTsNd免疫后小鼠血清IgG1明顯高于IgG2a（P<0.01），IgE抗體濃度也明顯升高，表明rTsNd免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th2型免疫應(yīng)答。應(yīng)用夾心ELISA對細(xì)胞因子的檢測結(jié)果表明，rTsNd與巨噬細(xì)胞共孵育后可抑制巨噬細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生；rTsNd免疫接種能促進(jìn)小鼠產(chǎn)生IL-4（P<0.05），但可抑制IFN-γ與IL-17的產(chǎn)生；提示rTsNd對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的免疫預(yù)防效果可能與rTsNd抑制炎性

23、細(xì)胞浸潤及抑制Th1與Th17應(yīng)答有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建了pMAL-c2X-TsNd重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功克隆表達(dá)了rTsNd。發(fā)現(xiàn)TsNd在旋毛蟲的各個發(fā)育時期中均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，主要定位于蟲體的表皮、生殖原基及生殖器官部位。
　　2．rTsNd具有良好的抗原性、免疫原性及Nudix水解酶活性，能與宿主的腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，rTsNd免疫小鼠對旋毛蟲攻擊感染具有部分免疫保護(hù)作用。
　　3．rTsN