IL-17基因轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細胞C26-IL-17的建立及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、目的:結(jié)腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，主要好發(fā)于40到50歲年齡組，發(fā)病率居胃腸道腫瘤的第三位，尤其在發(fā)達國家的發(fā)病率和死亡率極高。隨著我國人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，致使結(jié)腸癌的發(fā)病率也日趨增高。目前結(jié)腸癌的發(fā)病機制尚不清楚，是提高結(jié)腸癌治療效果的一個阻礙，因此本論文將結(jié)腸癌作為研究對象。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有很多種，如化學(xué)治療、物理治療、手術(shù)治療等，但是欲進一步改善患者的預(yù)后，還需尋找新的治療方法。腫瘤基因治療是

2、一種新的腫瘤治療方法，即把外源基因?qū)肽撤N細胞，進而將該細胞接種到荷瘤個體中，通過不斷合成外源基因編碼的蛋白而在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的功能，最終達到抑制甚至清除腫瘤細胞的目的。腫瘤基因治療的目的基因包括細胞因子、抗癌基因、腫瘤藥物相關(guān)基因等。細胞因子作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的小分子蛋白質(zhì)，在腫瘤基因治療中具有重要地位，目前，已有多種細胞因子作為候選者進行了研究，其中IL-17作為Th17細胞的特征性細胞因子引起了我們的興趣。細胞因子IL-1

3、7是輔助性T淋巴細胞亞群(Th17)所分泌的一種細胞因子，在炎癥性疾病及自身免疫性疾病中起重要的作用，可以促進前炎癥因子的釋放，屬于一種促炎細胞因子。目前的研究資料顯示，IL-17在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是IL-17發(fā)揮抗腫瘤作用還是促腫瘤作用還存在爭議。因此，本論文擬建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17基因的小鼠結(jié)腸癌細胞C26，并建立動物模型，對IL-17在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行研究。
　　方法:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)C26

4、/pcDNA3.1和C26/IL-17細胞株并進行鑒定體外培養(yǎng)小鼠C26細胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將攜帶IL-17基因的pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細胞C26，同時將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染C26細胞作為對照組細胞，經(jīng)G418篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達IL-17蛋白的C26細胞(C26/IL-17)。普通PCR法鑒定C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞中IL-17基因的表達，免疫熒光法鑒定三種細胞中IL

5、-17蛋白的表達。
　　2.劃痕修復(fù)實驗檢測細胞的遷移能力在24孔板中培養(yǎng)C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17細胞，當細胞生長達到80％到90％融合度時，用10μl的槍頭劃痕，用PBS洗去漂浮的細胞，然后再加入4％FCS完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、24h分別在倒置顯微鏡下觀察并拍照，檢測劃痕寬度的變化。遷移率=（劃痕初始寬度—目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。
　　3.檢測細胞體外增殖能力MTS

6、法檢測C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞體外增殖的情況，并繪制增殖曲線。
　　4.構(gòu)建荷瘤小鼠動物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細胞分別接種于小鼠背部皮下，每組20只，雌雄各半，觀察三組荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤大小生長情況、小鼠生存期變化情況。
　　5.荷瘤小鼠脾細胞增殖情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，利用密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，采用MTS法檢測

7、各組小鼠脾細胞增殖反應(yīng)，并繪制增殖曲線。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，采用MTS法檢測各組小鼠脾NK細胞殺傷活性（效靶比分別為40∶1，20∶1，10∶1）。
　　7.荷瘤小鼠脾細胞中Th1，Th2，Th17，Treg細胞特征性因子的表達情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，Real-Tim

8、e PCR法檢測小鼠脾淋巴細胞中Th1、Th2、Th17、Treg細胞特征性細胞因子和/或轉(zhuǎn)錄因子的表達。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)增殖情況檢測荷瘤小鼠接種腫瘤細胞5周后，分別取各組小鼠腫瘤組織，過濾法和密度梯度離心法分離TIL，采用MTS法檢測各組小鼠TIL的增殖反應(yīng)情況，并繪制增殖曲線。
　　9.小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞種類鑒定Real-Time PCR法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞中M1特征性細胞因子

9、IL-10和M2特征性細胞因子IL-12的表達。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株以pcDNA3.1質(zhì)粒為載體將IL-17基因成功轉(zhuǎn)染至小鼠結(jié)腸癌細胞，建立高表達IL-17的細胞株C26/IL-17。顯微鏡下觀察證實三種細胞形態(tài)沒有明顯變化;普通PCR結(jié)果顯示C26/IL-17細胞有IL-17基因的高表達，其他兩種細胞中僅見IL-17的微弱表達;免疫熒光檢測顯示C26/IL-17細胞有IL-17蛋白的表達，而C26、C26

10、/pcDNA3.1細胞未見IL-17蛋白的表達。
　　2.劃痕修復(fù)實驗檢測細胞的遷移能力劃痕修復(fù)實驗檢測結(jié)果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細胞遷移能力增強（P＜0.05）。
　　3.MTS法檢測三種細胞的體外增殖情況結(jié)果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細胞增殖能力明顯降低(P＜0.05)。
　　4.構(gòu)建小鼠荷瘤動物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-1

11、7三種細胞分別接種于小鼠背部皮下后，第七天可以摸到皮下腫瘤，從第十四天開始，每隔一天測量小鼠腫瘤大小。結(jié)果顯示，接種C26/IL-17細胞的小鼠的移植瘤體積明顯小于接種C26和C26/pcDNA3.1細胞的小鼠移植瘤體積(P＜0.05);接種C26和C26/pcDNA3.1細胞的小鼠移植瘤體積間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。并且接種C26/IL-17細胞的雄性小鼠移植瘤明顯小于雌性小鼠移植瘤體積(P＜0.05)，而接種C26、C26/p

12、cDNA3.1細胞的雌雄小鼠移植瘤大小之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。生存期結(jié)果顯示各組小鼠生存期之間均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　5.荷瘤小鼠脾細胞增殖情況檢測MTS法檢測各組小鼠脾細胞增殖反應(yīng)結(jié)果顯示性別因素對荷瘤小鼠脾細胞的增殖無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細胞的小鼠脾細胞較接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力強（P＜0.05），與正常小鼠脾細胞增殖能

13、力比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力較正常小鼠脾細胞增殖能力降低（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾細胞增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性檢測NK細胞殺傷活性檢測結(jié)果顯示性別因素對荷瘤小鼠脾NK細胞殺傷活性無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較結(jié)果顯示在效靶比為40∶1和20∶1時，接種三種細胞的小

14、鼠NK殺傷率較正常小鼠均降低（P＜0.05）;在效靶比40∶1時，接種C26/IL-17細胞比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠的脾淋巴細胞的NK殺傷率明顯增強(P＜0.05);效靶比10∶1時，各組之間沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;在效靶比40∶1、20∶1和10∶1時，接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠脾NK細胞殺傷率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　7.荷瘤小鼠脾細胞中Th1，Th2，Th1

15、7，Treg細胞特征性因子的表達情況檢測Real-Time PCR法檢測結(jié)果顯示，性別因素對此處結(jié)果無影響。接種C26/IL-17細胞的小鼠脾淋巴細胞較接種C26、C26/pcDNA3.1的表達更高水平的IFN-γ(Th1特征性細胞因子)、IL-4(Th2特征性細胞因子)、GATA-3(Th2特征性轉(zhuǎn)錄因子)、ROR-γt(Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子)、IL-10（Treg特征性細胞因子）mRNA(P＜0.05);接種C26、C26/pcD

16、NA3.1細胞的小鼠脾淋巴細胞表達IFN-γ、IL-4、GATA-3、ROR-γt、IL-10 mRNA的水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤的淋巴細胞(TIL)增殖情況檢測MTS法檢測各組荷瘤小鼠TIL的增殖反應(yīng)結(jié)果顯示，性別因素對TIL增殖能力無影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細胞的小鼠TIL較接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠TIL增殖能力強(P＜0.05);

17、接種三種細胞的小鼠TIL增殖能力較正常組小鼠均降低(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠TIL增殖能力無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　9.小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞種類鑒定Real-Time PCR法檢測各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤巨噬細胞中IL-10和IL-12mRNA表達結(jié)果顯示，性別因素對本指標無影響，IL-10和IL-12mRNA表達在各組荷瘤小鼠之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:

18、>　　1.成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17基因小鼠結(jié)腸癌細胞株(C26/IL-17)。轉(zhuǎn)染IL-17基因?qū)毎螒B(tài)沒有明顯影響，可以使細胞體外增殖減慢，細胞遷移能力增強。
　　2.成功建立了小鼠結(jié)腸癌模型，轉(zhuǎn)染IL-17基因可以抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，增強小鼠脾細胞增殖能力和NK細胞殺傷活性，可使小鼠脾細胞中Th1、Th2、Th17、Treg細胞分泌特征性因子增多。促進小鼠腫瘤浸潤的淋巴細胞增殖。
　　3.IL-17高表達對雄性小