IL-17基因轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞C26-IL-17的建立及其抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、目的:結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，主要好發(fā)于40到50歲年齡組，發(fā)病率居胃腸道腫瘤的第三位，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率和死亡率極高。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，致使結(jié)腸癌的發(fā)病率也日趨增高。目前結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是提高結(jié)腸癌治療效果的一個(gè)阻礙，因此本論文將結(jié)腸癌作為研究對(duì)象。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有很多種，如化學(xué)治療、物理治療、手術(shù)治療等，但是欲進(jìn)一步改善患者的預(yù)后，還需尋找新的治療方法。腫瘤基因治療是

2、一種新的腫瘤治療方法，即把外源基因?qū)肽撤N細(xì)胞，進(jìn)而將該細(xì)胞接種到荷瘤個(gè)體中，通過(guò)不斷合成外源基因編碼的蛋白而在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的功能，最終達(dá)到抑制甚至清除腫瘤細(xì)胞的目的。腫瘤基因治療的目的基因包括細(xì)胞因子、抗癌基因、腫瘤藥物相關(guān)基因等。細(xì)胞因子作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的小分子蛋白質(zhì)，在腫瘤基因治療中具有重要地位，目前，已有多種細(xì)胞因子作為候選者進(jìn)行了研究，其中IL-17作為T(mén)h17細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子引起了我們的興趣。細(xì)胞因子IL-1

3、7是輔助性T淋巴細(xì)胞亞群(Th17)所分泌的一種細(xì)胞因子，在炎癥性疾病及自身免疫性疾病中起重要的作用，可以促進(jìn)前炎癥因子的釋放，屬于一種促炎細(xì)胞因子。目前的研究資料顯示，IL-17在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是IL-17發(fā)揮抗腫瘤作用還是促腫瘤作用還存在爭(zhēng)議。因此，本論文擬建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17基因的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞C26，并建立動(dòng)物模型，對(duì)IL-17在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)C26

4、/pcDNA3.1和C26/IL-17細(xì)胞株并進(jìn)行鑒定體外培養(yǎng)小鼠C26細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將攜帶IL-17基因的pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞C26，同時(shí)將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染C26細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞，經(jīng)G418篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達(dá)IL-17蛋白的C26細(xì)胞(C26/IL-17)。普通PCR法鑒定C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細(xì)胞中IL-17基因的表達(dá)，免疫熒光法鑒定三種細(xì)胞中IL

5、-17蛋白的表達(dá)。
　　2.劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力在24孔板中培養(yǎng)C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80％到90％融合度時(shí)，用10μl的槍頭劃痕，用PBS洗去漂浮的細(xì)胞，然后再加入4％FCS完全1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在0h、24h分別在倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照，檢測(cè)劃痕寬度的變化。遷移率=（劃痕初始寬度—目前寬度）/2/劃痕初始寬度×100％。
　　3.檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力MTS

6、法檢測(cè)C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細(xì)胞體外增殖的情況，并繪制增殖曲線(xiàn)。
　　4.構(gòu)建荷瘤小鼠動(dòng)物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-17三種細(xì)胞分別接種于小鼠背部皮下，每組20只，雌雄各半，觀(guān)察三組荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤大小生長(zhǎng)情況、小鼠生存期變化情況。
　　5.荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖情況檢測(cè)荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，利用密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，采用MTS法檢測(cè)

7、各組小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，并繪制增殖曲線(xiàn)。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，采用MTS法檢測(cè)各組小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性（效靶比分別為40∶1，20∶1，10∶1）。
　　7.荷瘤小鼠脾細(xì)胞中Th1，Th2，Th17，Treg細(xì)胞特征性因子的表達(dá)情況檢測(cè)荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞5周后，分別取各組小鼠脾臟，密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，Real-Tim

8、e PCR法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞特征性細(xì)胞因子和/或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)增殖情況檢測(cè)荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞5周后，分別取各組小鼠腫瘤組織，過(guò)濾法和密度梯度離心法分離TIL，采用MTS法檢測(cè)各組小鼠TIL的增殖反應(yīng)情況，并繪制增殖曲線(xiàn)。
　　9.小鼠腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞種類(lèi)鑒定Real-Time PCR法檢測(cè)各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞中M1特征性細(xì)胞因子

9、IL-10和M2特征性細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株以pcDNA3.1質(zhì)粒為載體將IL-17基因成功轉(zhuǎn)染至小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞，建立高表達(dá)IL-17的細(xì)胞株C26/IL-17。顯微鏡下觀(guān)察證實(shí)三種細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化;普通PCR結(jié)果顯示C26/IL-17細(xì)胞有IL-17基因的高表達(dá)，其他兩種細(xì)胞中僅見(jiàn)IL-17的微弱表達(dá);免疫熒光檢測(cè)顯示C26/IL-17細(xì)胞有IL-17蛋白的表達(dá)，而C26、C26

10、/pcDNA3.1細(xì)胞未見(jiàn)IL-17蛋白的表達(dá)。
　　2.劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（P＜0.05）。
　　3.MTS法檢測(cè)三種細(xì)胞的體外增殖情況結(jié)果顯示C26/IL-17較C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞增殖能力明顯降低(P＜0.05)。
　　4.構(gòu)建小鼠荷瘤動(dòng)物模型將C26、C26/pcDNA3.1、C26/IL-1

11、7三種細(xì)胞分別接種于小鼠背部皮下后，第七天可以摸到皮下腫瘤，從第十四天開(kāi)始，每隔一天測(cè)量小鼠腫瘤大小。結(jié)果顯示，接種C26/IL-17細(xì)胞的小鼠的移植瘤體積明顯小于接種C26和C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠移植瘤體積(P＜0.05);接種C26和C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠移植瘤體積間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。并且接種C26/IL-17細(xì)胞的雄性小鼠移植瘤明顯小于雌性小鼠移植瘤體積(P＜0.05)，而接種C26、C26/p

12、cDNA3.1細(xì)胞的雌雄小鼠移植瘤大小之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。生存期結(jié)果顯示各組小鼠生存期之間均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　5.荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖情況檢測(cè)MTS法檢測(cè)各組小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果顯示性別因素對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞的增殖無(wú)影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞較接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞增殖能力強(qiáng)（P＜0.05），與正常小鼠脾細(xì)胞增殖能

13、力比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞增殖能力較正常小鼠脾細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6.荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)結(jié)果顯示性別因素對(duì)荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性無(wú)影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較結(jié)果顯示在效靶比為40∶1和20∶1時(shí)，接種三種細(xì)胞的小

14、鼠NK殺傷率較正常小鼠均降低（P＜0.05）;在效靶比40∶1時(shí)，接種C26/IL-17細(xì)胞比接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠的脾淋巴細(xì)胞的NK殺傷率明顯增強(qiáng)(P＜0.05);效靶比10∶1時(shí)，各組之間沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;在效靶比40∶1、20∶1和10∶1時(shí)，接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠脾NK細(xì)胞殺傷率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　7.荷瘤小鼠脾細(xì)胞中Th1，Th2，Th1

15、7，Treg細(xì)胞特征性因子的表達(dá)情況檢測(cè)Real-Time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，性別因素對(duì)此處結(jié)果無(wú)影響。接種C26/IL-17細(xì)胞的小鼠脾淋巴細(xì)胞較接種C26、C26/pcDNA3.1的表達(dá)更高水平的IFN-γ(Th1特征性細(xì)胞因子)、IL-4(Th2特征性細(xì)胞因子)、GATA-3(Th2特征性轉(zhuǎn)錄因子)、ROR-γt(Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子)、IL-10（Treg特征性細(xì)胞因子）mRNA(P＜0.05);接種C26、C26/pcD

16、NA3.1細(xì)胞的小鼠脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、IL-4、GATA-3、ROR-γt、IL-10 mRNA的水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　8.荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞(TIL)增殖情況檢測(cè)MTS法檢測(cè)各組荷瘤小鼠TIL的增殖反應(yīng)結(jié)果顯示，性別因素對(duì)TIL增殖能力無(wú)影響（P＞0.05）。各組間兩兩比較顯示接種C26/IL-17細(xì)胞的小鼠TIL較接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠TIL增殖能力強(qiáng)(P＜0.05);

17、接種三種細(xì)胞的小鼠TIL增殖能力較正常組小鼠均降低(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細(xì)胞的小鼠TIL增殖能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　9.小鼠腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞種類(lèi)鑒定Real-Time PCR法檢測(cè)各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞中IL-10和IL-12mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，性別因素對(duì)本指標(biāo)無(wú)影響，IL-10和IL-12mRNA表達(dá)在各組荷瘤小鼠之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:

18、>　　1.成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-17基因小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株(C26/IL-17)。轉(zhuǎn)染IL-17基因?qū)?xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響，可以使細(xì)胞體外增殖減慢，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。
　　2.成功建立了小鼠結(jié)腸癌模型，轉(zhuǎn)染IL-17基因可以抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞增殖能力和NK細(xì)胞殺傷活性，可使小鼠脾細(xì)胞中Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞分泌特征性因子增多。促進(jìn)小鼠腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞增殖。
　　3.IL-17高表達(dá)對(duì)雄性小